Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia

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1 Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia
TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA classica e MOLECULAR: APLICAÇÕES NO DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS Profa. Dra. Ana Elizabete Silva Departamento de Biologia IBILCE-UNESP

2 ... CITOGENÉTICA MOLECULAR aCGH FISH CGH SKY ISH 1960 1970 bandeamento
cariótipo culturas aCGH FISH CGH SKY ISH CITOGENÉTICA CLÁSSICA CITOGENÉTICA MOLECULAR ... 1956 Tijio e Levan 1960 Moorhead et al. 1970 1969 Gall e Pardue 1986 Pinkel et al. 1992 Kallioniemi et al. 1996 Schröck et al. 2002 Nakakuki et al.

3 CULTURA DE LINFÓCITOS Moorhead et al, 1960
1. Colheita de 5 ml de sangue e sedimentação 2. Montagem da cultura: meio de cultura (antibióticos) e soro fetal bovino estímulo da divisão celular: fito-hemaglutinina (feijão Phaseolus vulgaris) cultivo em estufa a 37° C, por 72 horas 3. Bloqueio da divisão celular com colquicina: impede a formação do fuso mitótico  acúmulo de metáfases 4. Colheita da cultura: hipotonização: KCl 0,075M  intumescimento das células e separação das cromátides Fixação: metanol: ácido acético (3:1) preserva a estrutura dos cromossomos

4 www.geneticamedica.com.br/.../ citogenetica.htm

5 BANDEAMENTO CROMOSSÔMICO
Coloração usual com Giemsa Bandeamento Q Bandeamento G Bandeamento R Bandeamento C Coloração Ag-NOR

6 COLORAÇÃO USUAL coloração uniforme dos cromossomos:identificação morfológica dos pares cromossômicos: 1, 2, 3, 16, 17, 18 e Y. Classificação dos cromossomos em grupos: A - G

7 CLASSIFICAÇÃO DOS CROMOSSOMOS HUMANOS (GRUPOS A – G)
Grupo A (1-3): 3 pares de cromossomos gandes A1 e A3 metacêntricos A2 submetacêntrico Grupo B (4-5): 2 pares submetacêntricos grandes Grupo C (6-12+X): 7 pares submetacêntricos médio + X Grupo D (13-15): 3 pares acrocêntricos médio (satélite) Grupo E (16-18): 3 pares de cromossomos pequenos 16 metacêntrico 17 e 18 submetacêntricos Grupo F (19-20): 2 pares metacêntricos pequenos Grupo G (21-22+Y): 2 pares acrocêntricos pequenos (satélite) + Y

8 46,XY biocarampangue.tripod.com/ Segundo-medio.htm

9 BANDA GTG: Seabright (1971)
Tratamento com tripsina e coloração com Giemsa Bandas claras e escuras intercaladas (450 bandas) Bandas G+ricas em AT (pobre em genes) Bandas G-ricas em GC (rica em genes) Identificação de alterações estruturais e pareamento dos cromossomos

10 www.ucm.es/.../AVG/practicas/ cariotipo/carioP.htm
cariotipo/carioP.htm

11 Décadas 70-80: estudo citogenético  identificação de cromossomos e regiões cromossômicas  diferentes alterações Perda: deleção monossomia Ganho: duplicação, amplificação trissomia, poliploidia Relocação: translocação inversão inserção

12 CULTURA CELULAR E BANDA G
500 bandas Resolução: ~6milhões pb ~50genes/banda >4 Mb

13 BANDA C (Sumner, 1972) cora regiões centroméricas e heterocromatina constitutiva: constrições secundárias dos cromossomos 1, 9, 16 e Yq. tratamento em ácido (HCl) e alcali Ba(OH)2 regiões de heterocromatina constitutiva: coradas fortemente  DNA da cromatina eucromatina  é extraído (solubilizado).

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15 BANDA C - POLIMORFISMOS CROMOSSÔMICOS
1 9 16 46,XY, 1qh+,inv(9q) 46,XX,1qh+ 46,XY, inv(9q)

16 BANDA Ag-NOR – COLORAÇÃO POR PRATA
destaca as regiões do rDNA: RON  constrições secundárias dos cromossomos com satélite (braços curtos dos acrocêntricos) (deposição de prata) o número de NORs/ metáfase: varia entre 5 a 10 Impregnação pela prata nos cistrons ribossômicos ativos na intérfase anterior

17 COLORAÇÃO Ag-NOR Associação de satélites

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19 ORDEM DAS ANOMALIAS CROMOSSÔMICAS SISTEMA INTERNACIONAL DE NOMENCLATURA DOS CROMOSSOMOS HUMANOS Primeiro aberrações dos cr. Sexuais (X antes do Y) Aberrações dos autossomos em ordem numérica, independente do tipo de aberração Aberrações numéricas listadas antes das estruturais Várias alterações estruturais em ordem alfabética Exemplos: 47,Y,t(X;13)(q27;q12),inv(10)(p13q22), +21 48,X,t(Y;12)(q11;p12),del(6)(q11),+8,t(9;22)(q34;q11),+1, 7,-21,+22 50,XX,+1,+del(1)(p13),+dup(1)(q21q32),+inv(1)(p31q41),+8,+r(10)(p12q25),-21

20 CARIÓTIPO COMPOSTO Cariótipo composto:
42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22 43,XX,-6,-11,-21 43,XX,-14,-18,-22 43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20 45,XX,-7 45,XX,-16 45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8 46,XX [4] 46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7] 46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5 46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8 Cariótipo composto: 42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]

21 ALTERAÇÕES CLONAIS Ter pelo menos 2 células com a mesma aberração:ganho cromossômico (trissomia) ou rearranjo estrutural Clone: população de células derivada de um único progenitor. Alteração clonal: quando um número de células têm o mesmo ou proximamente relacionado complemento cromossômico anormal. Ter pelo menos 3 células com perda cromossômica (monossomia)

22 ALTERAÇÕES CLONAIS Cariótipo composto: Numéricas: +5[2], -8[3]
42,XX,-7,-8,+13,-20,-21,-22 43,XX,-6,-11,-21 43,XX,-14,-18,-22 43,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-18,-20,-20 45,XX,-7 45,XX,-16 45,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),-8 46,XX [4] 46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32) [7] 46,XX, -X, ins(4;2)(q31;q24q32),+5 46,XX, ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-8 Numéricas: +5[2], -8[3] Estrutural: ins(4;2)(q31;q24q32)[11] Cariótipo composto: 42~46,XX,-X,ins(4;2)(q31;q24q32),+5,-6,-7,-8,-11,+13,-14,-16,-18,-20,-21,-22[cp20]

23 TECNOLOGIAS DE CITOGENÉTICA MOLECULAR
FISH: Hibridação in situ fluorescente (aneuploidias, rearranjos, amplificação) SKY: Cariotipagem espectral (alterações estruturais - translocações) M-BAND: Bandeamento colorido (inversão, deleção/duplicação) CGH: Hibridação Genômica Comparativa (perdas ou ganhos cromossômicos) Array-CGH: maior resolução (desbalanços genômicos)

24 HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE FISH
Pinkel et al. (1986)

25 HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
FISH: técnica de mapeamento físico de DNA em que uma sonda de DNA marcada com fluorocromo é hibridizada ao cromossomo ou núcleo interfásico e visualizado em microscópio de fluorescência Resolução: ~0,3 Kb (300 pb)

26 DNA Alvo: cromossomo ou região cromossômica
Sonda: segmento de DNA específico

27 ETAPAS Preparação da lâmina (DNA alvo) Denaturação: DNA alvo e sonda formamida a 70oC ou estufa To de ~80oC Fluorocromos: Sondas FITC-fluoresceína (verde) Espectrum green ( verde) Rodamina (vermelho) Texas red (vermelho) Hibridização sonda/DNA (estufa a 37oC – câmara úmida - overnight) Lavagem pós-hibridização: tampão 2xSSC (citrato de sódio) Detecção da sonda e contracoloração: iodeto de propídeo (PI) ou DAPI

28 ETAPAS Material: -núcleos interfásicos: tecido fresco, congelado, cortes histológicos, esfregaços -cromossomos metafásicos: cultura celular

29 ETAPAS (Ácido acético, RNase, pepsina Desidratação Etanol)

30 ETAPAS http://www.fisiologia.kit.net/main/anime.htm -ANIMAÇÃO
Hibridização (câmera úmida à 37oc) Tempo de vida limitado das lâminas:perda da fluorescência

31 TIPOS DE SONDAS Sondas que hibridizam estruturas cromossômicas específicas: -sonda alfa-satélite (centromérica) -sonda beta-satélite (satélite dos acrocêntricos D e G) -sonda satélite clássica (heterocromatina 1, 9, 16 e Y) -sonda telomérica (telômeros) Sondas de cópia única ou locus específica Sondas de cromossomo inteiro (WCP)

32 SONDAS CENTROMÉRICAS Enumeração dos cromossomos e aneuploidias

33 aneuploidias em núcleos interfásicos
SONDAS CENTROMÉRICAS gastrite: -7 gastrite:+7 APLICAÇÃO: aneuploidias em núcleos interfásicos úlcera: +8 Carcinoma de esôfago: tetrassomia 11 (verde)

34 SONDAS TELOMÉRICAS Aplicação: -Deleções terminais -perdas teloméricas

35 SONDAS TELOMÉRICAS (cromossomo 5)

36 SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
del (22q11.2) Diagnóstico de doenças com microdeleção

37 SONDAS LOCUS ESPECÍFICA
Adenocarcinoma gástrico: Deleção TP53 1 sinal vermelho Mucosa normal: TP53 (vermelho) 17 (verde) Deleção do gene TP53 em câncer gástrico

38 SONDAS WCP – Cromossomo Total

39 SONDAS WCP – Cromossomo Total
A- Criança com anomalias congênitas: sonda do cromossomo 4; material extra, braço curto de um dos cromossomos 4 (seta), B-  Metáfase da mesma criança: sonda do cromossomo 9. Dois cromossomos 9 normais; a parte extra do cromossomo 4 identificada como tendo origem no cromossomo 9 (seta).

40 APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH
Mapeamento de genes e sequências gênicas Estrutura e organização dos cromossomos Monitoramento de indivíduos/populações expostas à mutagênicos Identificação de rearranjos cromossômicos/ pequenas deleções Identificação de alterações cromossômicas em esperma Diagnóstico Pré-Natal e Pré-Implantação Monitoramento de pacientes leucêmicos/transplante de medula óssea (doador de sexo oposto) Diagnóstico de neoplasias

41 MICRODISSECÇÃO

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43 DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO
APLICAÇÕES DA TÉCNICA FISH DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL E PRÉ-IMPLANTAÇÃO

44 DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Trissomias 13, 18 e 21 e monossomia X: aneuploidias mais comuns relacionadas com idade materna avançada e malformações fetais Citogenética convencional: diagnóstico em 8-15 dias FISH: resultado rápido (2-3 dias) em células do líquido amniótico não cultivadas

45 DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH

46 DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL: FISH
Trissomia do 21 Triplo X Normal

47 DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTAÇÃO
3 sinais verde: blastômero com trissomia do 21

48 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA CCND1, c-MYC, HER2/Neu TRANSLOCAÇÕES t(9,22); t(8;14) DELEÇÕES TP53 (17p13), RB (13q13)

49 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
Amplificação Gênica

50 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS
Amplificação Gênica (C-D) Amplificação Her-2 ( vermelho) – câncer de esôfago e gástrico (E-F) Polissomia 17 (verde) gene Her-2 (vermelho)

51 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

52 DIAGNÓSTICO DE NEOPLASIAS TRANSLOCAÇÃO

53 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY

54 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Schrock et al., Science 273: , 1996 Identificação precisa e simultânea de todos os cromossomos humanos: diferentes cores Princípio: medição simultânea de todos os pontos do espectro emitidos pela amostra na faixa espectral visível e próxima a infra-vermelha: uso de múltiplas sondas sobrepondo-se espectralmente Sondas: com 5 diferentes fluorocromos : Cy2, Spectrum green, Cy3, Texas red e Cy5 e suas combinações

55 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Sondas dos 24 cromossomos humanos marcadas com 5 fluorocromos em combinação resultando em uma cor diferente para cada cromossomo.

56 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Classificação das cores pseudo-coloridas Cor capturada

57 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Cromossomos marcadores Limitação: -Cultivo celular – metáfases -Não detecta deleções/duplicações e inversão Cariótipo normal

58 CARIOTIPAGEM ESPECTRAL - SKY
Evolução cariotípica: células de gibão hibridizadas com sondas humanas  várias homologias cromossômicas

59 BANDAMENTO COLORIDO CROSS-SPECIES COLOR BANDING

60 BANDAMENTO COLORIDO Permite a coloração sub-regional dos cromossomos para análise do cariótipo humano Sondas: derivadas de primatas (gibão) do genêro Hylobates concolor e Hylobates syndactilus: cariótipos com extensa reorganização cromossômica quando comparado ao homem Identificação de rearranjos cromossômicos: inversões, deleções, duplicações, inserções, translocações

61 BANDAMENTO COLORIDO mBAND do cromossomo 5:
25 bandas coloridas: corresponde a uma resolução de 550 bandas (complemento haplóide)

62 BANDAMENTO COLORIDO Cromossomo 5 humano mostrando a imagem direta (a) e a imagem re-processada (b). Qualquer alteração pode ser detectada por este sistema. 

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64 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

65 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Método para detectar simultaneamente ganhos e perdas de regiões genômicas sem precisar de células em divisão Extração do DNA: células teste (tumor) e referência (normal) DNA digerido com enzimas de restrição e marcados com fluorocromos diferentes (vermelho e verde) Hibridação simultânea com ambos DNA (teste e referência) sobre lâmina com cromossomos metafásicos normais Comparação intensidade relativa dos dois fluorocromos ao longo do comprimento de cada cromossomo

66 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

67 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH
Amplificação/ganho: excesso do DNA teste (verde) Deleção/perda: excesso do DNA normal (vermelho)

68 HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA - CGH

69 Hibridização Genômica Comparativa (CGH) em câncer gástrico (Guan et al

70 array - CGH -cromossomos metafásicos substituídos por sondas de DNA ou oligonucleotídeos  chips DNA Resolução: 0,5 Mb

71 array - CGH Análise dos sinais fluorescentes: analisador de imagem, scanner confocal ou câmera CCD

72 array - CGH

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74 AVANÇOS TECNOLÓGICOS 1o. Microscópio -Leeuwenhoek

75 AVANÇOS TECNOLÓGICOS

76 Array-CGH continua transformando a Citogenética:
-fornecendo alta-resolução -tecnologia avançada para mapeamento preciso e detecção de aberrações cromossômicas.