UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FALCUDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS LABORATÓRIO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS - DEA LABORATÓRIO DE GENÔMICA E EXPRESSÃO - IB Projeto de Doutorado Determinação das Propriedades Lignocelulolíticas e Estudo Genético de Leveduras Silvestres Isoladas de Diversas Regiões Brasileiras Visando a Produção de Bioetanol Nome: Rosana Goldbeck Orientador: Prof. Dr. Francisco Maugeri Filho Co-Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Campinas, 2010

2 TÓPICOS ABORDADOS INTRODUÇÃO OBJETIVOS MATERIAS E MÉTODOS
RESULTADOS PRELIMINARES CRONOGRAMA DE ATIVIDADES

3 INTRODUÇÃO Recente retorno  preço do petróleo;
Perspectivas de esgotamento das fontes não-renováveis; Riscos geopolíticos decorrentes da dependência do petróleo de países politicamente instáveis; Preocupações de natureza ambiental  emissão de poluentes ao meio ambiente; Renascer Atenção nas Fontes Alternativas de Energia  Bioetanol

4 Nova tecnologia de produção de etanol 
Introdução Novo conceito de etanol (bioetanol) ou etanol de 2° geração  matéria-prima utilizada é biomassa lignocelulósica; Matérias-primas  sobras e resíduos de produtos naturais (sabugo e palha do milho, bagaço, pontas e palhas da cana-de-açúcar)  fundamentais p/ expressiva ampliação da produção de etanol; Nova tecnologia de produção de etanol  fundamental nos países desenvolvidos  matérias-primas hoje utilizadas competem produção de alimentos e $$$ produção são ainda altos.

5 Introdução Bioetanol de Celulose Utilização de biocombustíveis  emissão de gases tóxicos para a atmosfera  significativo interesse econômico e ambiental; Se faz necessário o uso da biotecnologia  conversão de celulose em etanol  perspectivas no desenvolvimento de enzimas  celulases; Busca de MO. capazes quebrar a celulose, fermentar o açúcar, tolerar  conc. etanol  produzir etanol. SFS Sacarificação e Fermentação Simultânea em Etanol

6 Conversão de celulose em etanol envolve 2 passos fundamentais:
Introdução Conversão de celulose em etanol envolve 2 passos fundamentais: (1) quebra das cadeias das moléculas de celulose em açúcares (2) fermentação desses açúcares em etanol Resíduos lignocelulósicos não são convertidos em etanol  polímeros complexos  leveduras não conseguem metabolizar “Engenheirar” um microrganismo (levedura)

7 Microbiota Silvestre Brasileira
Introdução Microbiota Silvestre Brasileira Brasil é o país de maior biodiversidade do Planeta  área de 8,5 milhões km2  diferentes zonas climáticas  variações ecológicas; Devido  biodiversidade  espécies fauna/flora  não são em sua totalidade conhecidas  nº espécies ainda não identificadas  dezena de milhões; Programas Aproveitamento Biodiversidade  Interesse  espécies de MO. ainda não catalogados  produtores insumos de interesse à indústria em geral.

8 Microrganismos Produtores de Celulases
Introdução Microrganismos Produtores de Celulases Embora muitos fungos e bactérias degradem a celulose Poucas cepas fungos têm sido consideradas  grandes produtoras enzimas capazes de degradar celulose insolúvel  açúcares solúveis PEIXOTO (2006) selecionou leveduras silvestres de diversas regiões brasileiras  potencial para produção de celulases

9 Objetivos Específicos
Objetivo Principal Estudar as propriedades lignocelulolíticas de leveduras silvestres isoladas de diversas regiões brasileiras, bem como realizar um estudo genético destas leveduras visando a produção de bioetanol. Objetivos Específicos Selecionar leveduras silvestres produtoras de celulose que apresentam potencial etanologênico; Identificar e caracterizar geneticamente as leveduras selecionadas; Isolar e Sequenciar genes específicos de celulase; Expressar o gene de interesse em Saccharomyces cerevisiae; Produzir Bioetanol  levedura geneticamente modificada.

10 MATERIAL E MÉTODOS Meio Sólido Potencial Seleção de Leveduras
Etanologênico Seleção de Leveduras Meio Sólido Meio Líquido CMCase Celobiase FPase Identificação da Levedura Isolamento e Seqüenciamento Genes Expressão em Saccharomyces Açúcares (ART e AR) Concentração Etanol Concentração Celular Viabilidade Celular Frascos Agitados Fermentador Produção de Bioetanol

11 Obtenção das Leveduras
Material e Métodos Obtenção das Leveduras Amostras coletadas de flores, frutos e solos de diversas regiões brasileiras (HERNALSTEENS, 2008). Tabela 1. Regiões na qual foram isolados os microrganismos. Fonte: Banco de culturas do LEB – FEA/UNICAMP.

12 Seleção das Leveduras Seleção em Meio Sólido
Material e Métodos Seleção das Leveduras Seleção em Meio Sólido Seleção das Leveduras  Capacidade de Degradação Carboximetilcelulose (CMC) Celulose (Troca Iônica) Meio Seletivo: 10 g/L CMC ou Celulose 0,6 g/L Extrato de Levedura 7,0 g/L KH2PO4 2,0 g/L K2HPO4 1,0 g/L (NH4)2SO4 15 g/L Agar pH 5,0 / 30ºC / 96 h  Revelação Vermelho Congo  Halo descolorido.

13 Atividade em Meio Sólido
Material e Métodos Atividade em Meio Sólido Metodologia descrita por STAMFORD et al. (1998) c/ alterações: Meio de cultura anterior  placas incubadas a 30 ºC por 96 horas; Vermelho de Congo  Halo descolorido  Paquímetro; Relação entre o DM Halo e DM Colônia  IEA; Análise de Variância  Teste Tukey (p≥0,05).

14 Seleção em Meio Líquido
Material e Métodos Seleção em Meio Líquido Meio Seletivo: g/L Celulose (Troca Iônica) 0,6 g/L Extrato de Levedura 7,0 g/L KH2PO4 2,0 g/L K2HPO4 1,0 g/L (NH4)2SO4 0,15 g/L MgS04.7H2O 0,01 g/L FeSO4.7H20 0,50 g/L KCl pH 5,5  Incubados a 30ºC e 150 rpm por 240 h  Centrifugação; Sobrenadante  3 Determinações de Atividade: CMCase Celobiase FPase

15 Material e Métodos Atividade de CMCase Metodologia proposta por OGAWA et al. (1982) c/ alterações: Mistura Reacional: ,0 mL CMC (10g/L) em Tampão Acetato 0,2 M 0,1 mL Solução Enzimática Banho Termostato a 45ºC  10 min 5 min banho fervente  banho gelo AR liberados  Método DNS  540 nm 1 unidade de Atividade de CMC  Capacidade da enzima em liberar 1 mol de glicose por min a partir da CMC original.

16 Atividade de Celobiase
Material e Métodos Atividade de Celobiase Metodologia proposta por HENRY et al. (1974): Amostra Reacional: 0,1 mL Celobiose (20mM) em Tampão Acetato 0,1 mL Solução Enzimática Banho Termostato a 45ºC  30 min 5 min banho fervente  banho gelo AR liberados  Método glicose-oxidase 1 unidade de Atividade de Celobiase  Capacidade da enzima em liberar 1 mol de glicose por min a partir da Celobiose original.

17 Material e Métodos Atividade de FPase Metodologia proposta por MANDELS et al. (1976) c/ alterações: Amostra Reacional: mg Papel Filtro Whatman nº 1 Tubos de ensaio com 2 mL Tampão Acetato 1 mL Solução Enzimática Banho Termostato a 45ºC  60 min 5 min banho fervente  banho gelo AR liberados  método DNS  540 nm 1 unidade de Atividade de FPase Capacidade da enzima em liberar 1 mol de glicose por min a partir do papel de filtro original.

18 Identificação Molecular
Material e Métodos Identificação Molecular Foram seqüenciadas as regiões espaçadoras utilizados os primers universais : ITS1 (5’ TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’) ITS4 (5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’) Também foram seqüenciados os domínios D1/D2 da subunidade 26S, utilizando os primers: NL1 (5’ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG 3’) NL4 (5’ GGTCCGTGTTTCAAGACGG 3’) Reações de Seqüenciamento  MegaBACE (GE Healthcare), no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS).

19 Isolamento e Seqüenciamento de Genes Específicos
Material e Métodos Isolamento e Seqüenciamento de Genes Específicos Protocolo Descrito por LEE et al. (2005): Serão utilizadas bibliotecas de cDNA construídas a partir do RNA extraído das leveduras celulolíticas; Para amplificação desses genes  desenhados primers degenerados  baseados em organismos filogeneticamente próximos a espécie de interesse; Genes serão clonados pGEM T-easy  Seqüenciados.

20 Expressão em Saccharomyces Cerevisiae
Material e Métodos Expressão em Saccharomyces Cerevisiae Expressão do gene de interesse na Saccharomyces cerevisiae  construção de um plasmídeo  SAMBROOK et al. (1989); Após construção plasmídeo, transformação DNA da S. cerevisiae  com acetato de lítio dimetilsulfona  descrito por HILL et al. (1991); Microrganismo geneticamente modificado será então submetido fermentações para produções de bioetanol de celulose.

21 Produção de Bioetanol Meio de Cultivo Frascos Agitados
Material e Métodos Produção de Bioetanol Meio de Cultivo 10 g/L Celulose (Troca Iônica) 0,6 g/L Extrato de Levedura 7,0 g/L KH2PO4 2,0 g/L K2HPO4 1,0 g/L (NH4)2SO4 0,15 g/L MgS04.7H2O 0,01 g/L FeSO4.7H20 0,50 g/L KCl Frascos Agitados 30ºC  150 rpm  120 horas

22 Material e Métodos Fermentador Fermentação  Fermentador Bioflo III  volume útil de 2,5 L; Meio de cultura  Mesmo utilizado fermentações frascos agitados; Fermentações em batelada  Controle Temperatura (30ºC) e Agitação (300 rpm); Agitador tipo turbina de pás planas; Sistema possuirá medidores on-line de vazão de CO2, pH e turbidez.

23 Métodos Analíticos Açúcares Redutores Açúcares Totais
Material e Métodos Métodos Analíticos Açúcares Redutores Determinação de Açúcares Redutores será utilizado o Método Espectrofotométrico – 3,5-DNS  MILLER (1959). Açúcares Totais Determinação de Açúcares Totais será utilizado o Método de Antrona  TREVELYAN & HARRISON (1952).

24 Determinação de Etanol
Material e Métodos Determinação de Etanol Amostras  centrifugadas  sobrenadante  diluído e filtrado com membrana microporosa; Amostras colocadas em “vials” para injeção automática mo HPLC; Cromatógrafo líquido (HPLC)  operado através do uso de uma fase móvel (solução de H2SO4 pH = 1,4)  vazão da coluna  0,7 mL/min.

25 Concentração de Células Totais
Material e Métodos Concentração de Células Totais Análise gravimétrica  peso seco  estufa com circulação de ar e temperatura constante a 70°C. Viabilidade Celular Técnica redução do azul de metileno descrita YOSHIDA et al. (1999); Método baseia-se no fato células viáveis reduzirem o corante azul de metileno a azul leucometileno  incolores; células não viáveis não apresentam esta capacidade  azuis.

26 RESULTADOS PRELIMINARES
SELEÇÃO EM MEIO SÓLIDO 16 leveduras silvestres  banco de culturas do Laboratório de Engenharia de Bioprocessos (LEB) – FEA/UNICAMP; Cultivadas em placas de Petri  Meio: carboximetilcelulose (CMC) e celulose (SERVACEL®) como única fonte de carbono; Selecionadas por meio da observação de um halo descolorido formado em torno da colônia  presença de enzimas hidrolíticas; De um total de 16 leveduras  5 leveduras apresentaram halo descolorido em ambos os meios.

27 SELEÇÃO EM MEIO SÓLIDO Resultados Preliminares
Figura 1. Halo de hidrólise formado ao redor da colônia quando cultivada em meio sólido por 96 horas à 30 ºC.

28 ATIVIDADE EM MEIO SÓLIDO
Resultados Preliminares ATIVIDADE EM MEIO SÓLIDO IEA  relação entre diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia  avaliar a capacidade de produção de enzimas por mo. em meio sólido. Figura 2. Índices enzimáticos de atividade registrados para as 5 cepas de leveduras cultivadas em meio sólido.

29 SELEÇÃO EM MEIO LÍQUIDO
Resultados Preliminares SELEÇÃO EM MEIO LÍQUIDO Seleção em meio líquido fermentações das 5 leveduras que se destacaram  produção de celulase no cultivo em meio sólido; Fermentações  meio contendo celulose (SERVACEL®) como única fonte de carbono  monitoradas 240 h; Amostras  coletadas a cada 48 horas  posterior análise da atividade enzimática do caldo fermentado; Determinação da atividade  3 experimentos distintos: Atividade em carboximetilcelulose (CMCase) Atividade de hidrólise em papel filtro (FPase) Atividade de celobiase

30 ATIVIDADE DE CMCASE Resultados Preliminares
Figura 3. Gráfico da Atividade de CMCase em relação ao tempo de fermentação para as 5 leveduras estudadas.

31 ATIVIDADE DE FPASE Resultados Preliminares
Figura 4. Gráfico da Atividade de FPase em relação ao tempo de fermentação para as 5 leveduras estudadas.

32 Atividade de celobiase
Resultados Preliminares Atividade de celobiase Figura 5. Gráfico da Atividade de Celobiase em relação ao tempo de fermentação para as 5 leveduras estudadas.

33 INICIOU  16 LEVEDURAS SILVESTRE SELEÇÃO EM MEIO LÍQUIDO
Resultados Preliminares INICIOU  16 LEVEDURAS SILVESTRE SELEÇÃO EM MEIO SÓLIDO 5 LEVEDURAS SILVESTRE SELEÇÃO EM MEIO LÍQUIDO 1 LEVEDURA SILVESTRE AAJ6

34 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
Resultados Preliminares IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR Figura 6. Eletroforese realizada no teste de determinação da temperatura ideal de anelamento dos primers utilizados para a amplificação do DNA. (a) marcador GeneRuler™ 100 bp; (b) branco ITS1 e ITS4; (c) AAJ6, 52°C, ITS1 e ITS4; (d) AAJ6, 55°C, ITS1 e ITS4; (e) AAJ6, 58°C, ITS1 e ITS4; (f) branco NL1 e NL2; (g) AAJ6, 52°C, NL1 e NL4; (h) AAJ6, 55°C, NL1 e NL4; (i) AAJ6, 58°C, NL1 e NL4.

35 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
Resultados Preliminares IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR PCR  40 ciclos a 58°C; Produto do PCR  Purificado e Quantificado; Reação de Seqüenciamento  MEGABACE  LNLS; Seqüência obtidas  comparadas com as seqüência depositadas nos bancos de dados  BLAST; Acremonium strictum

36 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR
Resultados Preliminares IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR

37 CRONOGRAMA DE ATIVIDADES

38 Muito Obrigada!