FERMENTAÇÃO – BIOQUÍMICA E BIOTECNOLOGIA Morfologia e Fisiologia de Micro-organismos - PPGBBM Mestranda: Lorena Mendes Araujo

FERMENTAÇÃO Mecanismo anaeróbio de produção de energia que não envolve cadeia respiratória ou citocromos. Obtenção de ATP na ausência de O2

GLICÓLISE Glicose: principal combustível; posição central no metabolismo. Vários destinos da glicose - oxidação a um composto de 3 carbonos (Piruvato) através da glicólise.

GLICÓLISE Glicose é degradada em um série de reações catalisadas por enzimas para liberar 2 moléculas de piruvato. Glicose (6 C)  2 mol de piruvato (3C) numa seqüência de 10 passos. 5 primeiras = fase preparatória ( perda de 2 ATP) 5 últimas = fase de pagamento ( ganho de 4 ATP e 2 NADH) Saldo (+)  2 ATP e 2 NADH Produto final  2 moléculas de Piruvato

O Piruvato pode seguir 3 rotas metabólicas: organismos aeróbicos  respiração aeróbica Piruvato é oxidado, perdendo CO2; Acetil CoA - ciclo do ácido cítrico - é então totalmente oxidado a CO2; Os elétrons originados são passados para o O2 - cadeia transportadora  formando H2O. A energia liberada nas reações de transferência de elétrons permite a síntese de ATP nas mitocôndrias. Os organismos anaeróbicos: possuem mais 2 rotas (fermentação) Redução do piruvato a lactato através da fermentação do ácido lático. Metabolismo do piruvato, tendo como produto o etanol (fermentação alcoólica)

Fosforilação Oxidativa Glicólise Etanol Ácido lático Ácido Pirúvico AcetilCoaA Ciclo de Krebs Cadeia Respiratória Glicose Fosforilação Oxidativa Fermentação Respiração Aeróbica

FERMENTAÇÃO Transformação de uma substância em outra, produzida a partir de microorganismos; Processo de obtenção de energia utilizado por algumas bactérias e outros organismos; Quebra da glicose (ou outros substratos como o amido) em piruvato, que depois é transformado em algum outro produto (álcool etílico, lactato, outros). Este tipo de obtenção de energia não necessita do O2 como aceptor final de elétrons (respiração anaeróbica); 18x menos eficiente (energia) – gerando 2 ATPs por molécula de glicose  “Efeito Pasteur”

Exemplo de fermentação: Transformação dos açúcares das plantas em álcool - fabricação da cerveja, massa de pão, entre outros; Músculos - atividade fisica intensa e na ausência de oxigenio, com a formação de lactato ; Modificar um material cuja modificação seria difícil ou muito cara se por métodos químicos convencionais;

Histórico: Habitantes das cavernas - carne envelhecida tem sabor mais agradável que a carne fresca; Vinho, cerveja, e pão são tão velhos quanto a agricultura. Pães foram encontrados nas pirâmides egípcias; Queijo, que envolve a fermentação de leite ou creme é outra comida muito antiga, sua fabricação na China e no Japão é conhecida há milhares de anos; O valor medicinal de produtos fermentados é conhecido há muito tempo – Chineses usavam coalho de feijão-soja mofado para curar infecções de pele (3.000 anos atrás); Os índios da America Central tratavam feridas infetadas com fungos.  

A química das fermentações é uma ciência nova, em suas fases mais iniciais. É a base de processos industriais que convertem matérias-primas (grãos, açúcares, e subprodutos industriais) em produtos sintéticos; Cepas cuidadosamente selecionadas de mofos, leveduras e bactérias, e são usadas.  1ª indústrias a utilizarem tecnologia de fermentação foram as fábricas de cerveja – final do século XIX e início do século XX que essa tecnologia usada na indústria de bebidas e alimentos, como na indústria química; Na I Guerra Mundial as necessidades de acetona (na produção de explosivos) estimularam a pesquisa no potencial da tecnologia de fermentação;

Descoberta casual: melão embolorado (Penicillium) produzia 10x mais penicilina que o bolor de Fleming cultivado em meio sólido. Outros antibióticos apareceram rapidamente. Importante na indústria farmacêutica. A cada ano novos produtos são incorporados à lista de produtos derivados da fermentação. Riboflavina(B2); Cianocobalamina(B12); Ácido ascórbico (Vit C);  

Ácido cítrico - usado em limpadores de metal e como um preservativo e agente de sabor em alimentos fermentação de melado com o mofo Aspergillus niger.   Terramicina - rações animais para acelerar o crescimento dos animais e os proteger de doenças. 

BIOTECONOLOGIA Aplicação em grande escala dos avanços científicos e tecnológicos, a partir de organismos vivos (células e/ou moléculas) para produção racionalizada de substâncias, que resultam em produtos comercializáveis. A biotecnologia encontra muitas aplicações importantes em: Indústria (química, petroquímica, alimentos, farmacêutica) Agricultura/Pecuária Saúde Preservação do meio ambiente Crescimento a partir da década de 70 tecnologia do DNA recombinante.

BIOPROCESSOS Compreendem um conjunto de operações que incluem: tratamento da matéria prima; preparo dos meios de propagação e produção; esterilização e a transformação do substrato em produto(s); processos de produção; processos de separação e purificação de produto(s). Bioprocessos x Processos químicos - natureza dos catalisadores utilizados em suas reações. São conduzidos: microrganismos; células animais ou vegetais; enzimas.

BIOPROCESSOS CATALISADOS POR ENZIMAS Proteína sintetizada na célula viva que catalisa uma reação termodinamicamente possível. Ocorrência universal nos materiais biológicos. São hidrossolúveis.   Importância nas áreas: farmacologia, tecnologia de alimentos, toxicologia, medicina, engenharia química, biotecnologia, etc.   

Origens: Humana : pepsina (estômago), amilases (saliva), proteases, amilases, lipases (pâncreas), renina (estômago de ruminantes); Vegetal: papaina (mamão), bromélina (abacaxi), ficina (figo); Microbianas( bactérias, leveduras, fungos ).   Presença indesejável: escurecimento de vegetais; rancificação, etc.

Classificação das enzimas: OXIDO-REDUTASES: catalisam as reações de óxido-redução. Ex: desidrogenases, oxidases, peroxidades. HIDROLASES: catalisam as reações de hidrólise.   TRANSFERASES: catalisam a transferência de grupos. Ex transaminases quinases, transacetilases. ISOMERASES: catalisam diferentes tipos de isomerisação. LIGASES: catalisam reações que unem duas moléculas conjugadamente com o rompimento de uma ligação pirofosfórica. LIASES : catalisam reversivelmente a remoção de grupos do substrato não hidroliticamente.

Vantagens Desvantagens Baixo consumo de energia Enzimas com alto grau de pureza Pequena produção de produtos colaterais (especificidade) Aproveitamento quase total da matéria-prima Reações de fácil controle   Desvantagens Dificuldade de reutilização de algumas enzimas Uso restringido de algumas enzimas pela necessidade de co-fator Reações susceptíveis à ação de substâncias inibidoras

Substrato Matérias-primas são utilizadas como fonte(s) de substrato(s) e outros nutrientes; As matérias-primas de bioconversões podem ser agrupadas em função da estrutura e da complexidade molecular dos substratos; É um dos componentes mais relevantes nos custos de produção; Nutrientes adequados à geração do produto de interesse está relacionada à atividade metabólica desenvolvida pelos microrganismos. As condições que permitem a produção máxima de massa molecular não são necessariamente as mesmas que permitem a máxima produção de um determinado produto.

Substratos solúveis - facilmente extraídos produto Substratos solúveis - facilmente extraídos produto. Ex: sacarose, glicose, frutose e lactose, provenientes de cana-de-açúcar, beterraba, melaço, soro de leite, etc. Substratos insolúveis - precisam de tratamento moderado para solubilização e hidrólise, antes da conversão em produto(s) como por exemplo, amido de milho, mandioca, trigo, cevada, batata, etc. Substratos insolúveis muito resistentes, que necessitam de pré-tratamento físico, hidrólise química ou enzimática para produzir substratos que serão convertidos em produto. Ex: celulose e hemicelulose.

Agentes de fermentação: Microrganismos Bactérias Exploradas industrialmente para acumular produtos intermediários e finais do metabolismo; São uma rica fonte de produção de enzimas. Fungos: 2 grandes grupos: bolores e leveduras; Vírus A cultura de vírus para testar drogas antivirais e para a produção de vacinas - importante empreendimento industrial.

Fontes de microrganismos de interesse Isolamento a partir de recursos naturais; Compra em coleções de cultura; Obtenção de mutantes naturais; Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais; Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética.

Características desejáveis de microrganismos elevada eficiência na conversão do substrato em produto; não produzir substâncias incompatíveis com o produto; apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico; não ser patogênico; não exigir condições de processo muito complexas; não exigir substratos dispendiosos; permitir a rápida liberação do produto para o meio.

Exemplo dos microorganismos mais utilizados na biotecnologia: Lactobacillus Aspergillus niger Saccharomyces cerevisiae Acetobacter_aceti Pichia pastoris Penicilium

DESENVOLVIMENTO DOS AGENTES DE FERMENTAÇÃO E ESTADO FÍSICO DO SUBSTRATO Substrato líquido superfície profundidade (submerso) Substrato sólido ou semi-sólido Fermentação em estado líquido: de grande quantidade de água; tanques de fermentação; aumento de escala para muitos produtos limitados pelo processo de fermentação em meio sólido; álcool etílico; bebidas alcóolicas; antibióticos; vitaminas; vacinas; enzimas; insulina e muitos outros.

Meio líquido e na superfície: Vantagens: medição e controle de pH, temperatura, oxigênio, produto substrato; separação e purificação do produto; maior facilidade de se ter um processo contínuo e automatizado. Meio líquido e na superfície: Biomassa situa-se na superfície do meio líquido, em contato direto com o ar atmosférico; A difusão e a relação entre a área e o volume de meio têm papel importante em bioprocessos operados em superfície; Operação difícil e são considerados antieconômicos; Usados em processos com fungos filamen-tosos;

Meio líquido submersos: microrganismo produtor se desenvolve no interior do meio de fermentação (com agitação); A maioria das fermentações industriais importantes; Vantagens: podem-se manipular, com maior facilidade; a massa fica totalmente submersa no meio nutriente de maneira uniforme; a absorção de nutrientes e excreção de metabólitos são executadas com maior eficiência; menores tempos de fermentação, melhor produtividade;

Fermentação em estado sólido: a cultura de microrganismos sob ou no interior de partículas em matriz sólida; Evolução: 2.600 a.C. Produção de pão pelos egípcios Século XVIII Produção de vinagre de polpas 1.900 -1920 Produção de enzimas fúngicas 1.920 -1940Enzimas fúngicas, ác.cítrico 1.940 -1.950 Produção de penicilina 1.950 -1.960 Produção de esteróis 1.960 -1980 Micotoxinas e alimentos enriquecidos 1.990 -.... Vários outro produtos, enzimas, álcool

Suporte sólido atua também como fonte de nutrientes; Os substratos tradicionalmente utilizados são: arroz, trigo, cevada, milho e soja; resíduos agro-industriais e florestais (bagaço de cana-de-açúcar, o sabugo de milho, o farelo de trigo e a palha de arroz); custos de produção associados diretamente; Operação pode ser realizada sem agitação mecânica, com agitação ocasional ou contínua em reatores

Vantagens: Fatores limitantes: Simplicidade dos meios de fermentação; O substrato sólido pode requerer somente adição de água, embora outros nutrientes possam ser adicionados; Não requer máquinas e equipamentos sofisticados; Demanda reduzida de energia; Baixo grau de umidade, reduzindo os problemas de contaminação; As condições de crescimento do microrganismo são similares às do seu ambiente natural; Ausência de formação de espuma; Fatores limitantes: Menor acessibilidade e disponibilidade de substrato; Problemas de transferência de massa (oxigênio e nutrientes), calor; Dificuldades no Controle de variáveis físico-químicas: pH, temperatura, oxigênio; Dificuldades no aumento de escala.

Biorreatores Reatores bioquímicos, reatores biológicos, os reatores químicos; ocorre uma série de reações químicas catalisadas por biocatalisadores; Formas de condução de bioprocessos Descontínuo simples (batelada) Com recicurlação de células Sem recicurlação de células Descontínuo alimentado sem recirculação de células com recirculação de células Contínuo executado em um reator (com ou sem recirculação de células) executado em vários reatores (com ou sem recirculação de células)

Descontínuo simples – “batelada” simples Sistema fechado e de volume constante; Na prática dificilmente será aplicado industrialmente; Constitui a base para as comparações de eficiências atingidas,estimulando vias alternativas; O processo descontínuo simples (1 inóculo por tanque): preparação do substrato adequado ao desenvolvimento do microrganismo; substrato em um biorreator; adicionar o microrganismo responsável pelo bioprocesso; aguardar que o processo ocorra; Após o tempo necessário, retira-se o caldo do biorreator e executa-se as operações unitárias necessárias para a recuperação e purificação do produto.

Problema: fenômenos de inibição pelo substrato, produto, ou outros metabólitos. Concentrações elevadas de substrato inibem o agente biológico repressão na síntese de enzimas desidratação dos sistemas enzimáticos (perda de H2O ou inibição do transporte de nutrientes) Vantagens: Fácil operação; Menor risco de contaminação; Construção e instrumentação simples e barata; Processo adequado para curtos períodos de tempo; Versatilidade de usos.

Desvantagens: Esgotamento do meio de cultivo e acúmulo de compostos tóxicos ou degradação do produto; Menor produtividade volumétrica; Preparo do reator entre uma batelada e outra reduz tempo útil e aumenta custos.

Descontínuo com recirculação de célula Há o reaproveitamento como inóculo, o microrganismo da batelada anterior (comum em destilarias de álcool); Sedimentação no fermentador (cervejarias); Centrifugação do meio fermentado; Tendência em aumentar o número de contaminantes a cada nova batelada Leite de lêvedo (suspensão altamente concentrada) com água e ácido sulfúrico  2 a 3h sob agitação: elimina contaminantes e células que já se apresentem em fase de degeneração

Descontínuo alimentado Manutenção da concentração dos inibidores/repressores em níveis sub-inibitórios/sub-repressores, com implicações diretas no desempenho da célula. Modo de operação na qual um ou mais nutrientes necessários ao crescimento celular são adicionados ao biorreator, intermitentemente ou continuamente, sem que ocorra retirada de material durante a operação; Usado na produção de várias enzimas e antibióticos;