Clonagem de um determinado gene de interesse

Alteração da biossíntese das hemiceluloses e ácidos urônios: consequências para a formação da parede celular secundária em plantas Laboratório “Max Feffer de Genética de Plantas Departamento de Genética Esalq/Usp

De que forma? Através da clonagem e expressão de genes envolvidos na biossíntese de hemiceluloses e ácidos urônicos em plantas de tabaco e eucalipto. Avaliar o impacto dessas alterações no conteúdo dos polissacarídeos da parede celular das plantas transgênicas de tabaco e eucalipto

Xilana UDP Glucuronato Ácido Glucurônico Parede Celular UDP-Xilose UDP-Glucose Glucose 1-P Glucose 6-P Celulose Inositol 1-P Mio-inositol Parede Celular Glucuronato 1-P Rota metabólica de formação de Xilanas, Celulose e Ácido glucurônico a partir do açúcar Glicose 6-P e da via de oxidação do Mio-inositol Adaptação: ox. dc. ct.ox. df.

2ª-Parte

Busca em banco de dados O cDNA desse gene foi clonado, a partir de uma biblioteca de cDNAs do NCBI: 4) ugdh: Glycine max (Tenhaken e Thulke, 1996);

Análise de Blast X (NCBI)

BLASTP Query= gi| UDP- glucose dehydrogenase [Glycine max] (480 letters)

Presença de domínio conservado na sequência (Pfam) > 480 aa MV KICCI GAGYVGG PTMAVIALKCPSVEVAVVDISVSRIQAWNSEQLPIY EPGLDAVVKQCRGKNLFFSTDVEKHVFEADIVFVSVNT P TKTRGLGAGKA ADLTYWESAARMIADVSKSDKIVVEKSTVPVKTAEAIEKILTHNSKGIKF QILSN P EFLAEGTAIQDLFAPDRVLIGGRETPEGQKAIQTLKDVYAHWVP EDRILTTNLWSAELSKLAANAFLAQRISSVNAMSSLCEATGADVAQVSYA VGKDSRIGPKFL NAS V GFGGSCFQKDIL NLVYICECNGLPEVAEYWKQVI KINDYQKARFVNRVVSSMFNTVSNKKIAILGFAFKKDTGDTRETPAIDVC KGLLGDKARLSIYDPQVTEEQIQRDLTMNKFDWDHPVHLQPMSPTTVKQV SVVWDAYDAVKDAHGLCILTEWDEFKTLDYQRIYDNMQKPAYIFDGRNVV NVNKLREIGFIVYSIGKPLDPWLKDMPAVA Sequência de aminoácidos do cDNA daUgdhde soja. O Iniciador da transcrição-nt motif está em lilás (aa 1 e 2). O sítio de pareamento do cofator NAD (aa# 8-14) está em vermelho. O sítio catalítico (aa# , com a Cys central, está em azul. As prolinas, nas posições 89 e 156, estão em verde. Um sítio putativo de glicolisação (aa# ) está em amarelo.

primer3

Etapas da Clonagem Extração RNA Total soja (Salzman et al., 1999) RNA mensageiro (Kit Dynal) primers que flanqueiam por completo a ORF do gene de interesse, contendo uma sequência de direcionamento (CACC) RT-PCR (Kit Invitrogen)

Clonagem do cDNA do gene de interesse no vetor pEntry-D-TOPO Produto RT-PCR Reação TOPO cloning (LR clonase/ Kit Invitrogen)

p-ENTRY-D- Cloning Vector

Sequenciamento Vetor pEntry-D-TOPO (contendo o gene de interesse) + primers universais M13 sense e antisense Análise de BLASTX (NCBI) (Em colaboração com o laboratório da Dra Siu Mui Tsai (Cena/Usp)

Sub-clonagem do cDNA do gene de interesse no vetor pDEST Invitrogen pDEST 17 Gateway TM

Gene de interesse no interior do pDEST

Sequências de Shine Dalgarno e Kozak Sítio de acoplamento do ribossomo que promove a eficiente e correta tradução do mRNA em procariotos (ex: E. coli) AGGAGG Em Eucariotos, a sequência equivalente à sequência de Shine- Dalgarno em procariotos é a sequência de Kozak (ex: Levedura) A/GCCATGG

Expressão da Proteína em E. coli E. coli Expression System with Gateway Technology (Invitrogen) BL21-AI TM KDa 116,2 97,4 66,2 45,0 31,0 MW NIA A A Clone 1 Clone 2 Clone 3 SDS-PAGE da proteína ugp (53 KDa), referente ao cDNA de batata clonado, expressa em E. coli. Cultura controle não-induzida (C) e induzida (I) com arabinose. PM: “Mid-Range Protein Markers-KDa” (Promega). Batata: 53KDa

Sequenciamento da Proteína Espectrometria de massas Micromass Waters Q-TOF API Ultima

Análise de Blast

Sub-clonagem em Vetor Binário de Transformação de Plantas Patente n◦ PI Gene de interesse BE BDR1R2 pK7WG2D bordas do T-DNA Gene nptII terminador nos promotor nos promotor 35S attR1 attR2 ccdB CmR Terminador 35S Gene Egfp promotor rolD Karimi et al. (2002)