Seção de Bacteriologia -Instituto Adolfo Lutz - São Paulo Streptococcus pneumoniae Dra. Maria Cristina de Cunto Brandileone Setor de Bactérias Piogênicas e Toxigênicas Seção de Bacteriologia -Instituto Adolfo Lutz - São Paulo

sair índice Histórico Diagnósticos Otites Coleta de amostra Identificação Streptococcus pneumoniae fluxograma Identificação Streptococcus pneumoniae Cápsula Polissacarídica Resistência do Pneumococo a Penicilina R a PEN: NCCLS Métodos para Sensibilidade Antimicrobiana de Pneumococo Difusão em disco Cuidados Isolados de liquor Fenótipos de R raros, não reportados ou erro técnico CIM Vigilância Laboratorial do S. pneumoniae R a PEN no Brasil: cepas invasivas Sorotipos Prevalentes de S.pneumoniae Brasil doença invasiva Cobertura estimada potencial da vacina conjugada 7-valente Sorotipos associados a R à PEN índice sair

índice sair Histórico 1881 Pasteur, França Stemberg, EUA Estudos transformação genética antígeno-anticorpo imunidade celular (fagocitose) imunidade humoral vacinas polissacarídicas

índice sair História Natural das Infecções de Transmissão Respiratórias sair índice Colonização de nasofaringe (Portador) Infecção localizada: Otite média aguda e sinusite Pneumonia Meningites Abscesso Infecção “invasiva” bacteriemia sepsis

índice sair Diagnósticos Diagnóstico Bacteriológico das Meningites: 1- Bacterioscópico de LCR (Gram) 2- Cultura de LCR em ágar chocolate 3- Cultura de sangue Diagnóstico Bacteriológico das Pneumonias: 1- Cultura de sangue 2- Cultura de LP ou lavado brônquico 3- Bacterioscópico de aspirado traqueal

índice sair Diagnósticos Secreção do Trato Respiratório Inferior 1- Cultura de líquido pleural 2 - Escarro e aspirado traqueal (?) 3 - Lavado brônquico com proteção Diagnóstico das Infecções das Vias Aéreas Superiores: Secreções

índice sair Otites 1 - Interna Timpanocentesis para casos recorrentes e crônicos S. pneumoniae, H. influenzae, Moraxella catarrhalis, S. aureus, outros 2 - Externa Com swab limpando-se bem o canal externo. P. aeruginosa, outros. Observar contaminantes.

Coleta de amostra ou espécime clínico sair índice A amostra deve representar processo infeccioso evitando-se contaminação Amostra de pouco valor clínico : fonte de contaminação com microbiota - obtenção de super-crescimento. Exemplo de possíveis contaminação: hemocultura, secreção do ouvido médio, sinus nasal, infecção sub- cutânea e feridas Sucesso depende: 1- seleção da amostra 2- coleta com qualidade 3- transporte adequado 4- racional e qualidade no processamento da amostra ex: sub-cultivo da hemocultura obrigatório após 6 –18 horas, 72 hs e final - 7 dias ágar chocolate e MacConckey

Streptococcus pneumoniae Identificação Streptococcus pneumoniae sair índice Coloração de Gram Crescimento em agar sangue-carneiro 5%: colônia e hemólise Ausência da catalase Sensibilidade a optoquina (5ug) Solubilidade em sais biliares (2%)

índice sair Identificação Streptococcus pneumoniae Isolamento: placa de agar sangue-carneiro 5% (AS) Observação do crescimento: colônias brilhantes, translúcidas ou mucóides alfa-hemolíticas Cultura contaminada: Reisolar colônia em placa AS 18 h 35 0C Exame microscópico da cultura: Coloração de Gram “Diplococo Gram + - DGP” 18 hrs 35 0C Repique em 2 tubos agar Chocolate (Ach) e/ou placa AS 18 h, 35 0C Suspensão do crescimento em salina: catalase, optoquina e bile-solubilidade (BS) optoquina 20 - 24 h, 35 0C Catalase - BS + Optoquina + Catalase - BS + Optoquina - Catalase - BS - Optoquina - Antibiograma e/ou CIM S. pneumoniae S. grupo viridans Manter a cepa e enviar ao IAL com os dados do paciente e da cepa: nome, idade, suspeita clínica, material clínico de isolamento S. pneumoniae: catalase -, DGP, colônias alfa-hemol em AS BS +, optoquina + / - sair índice

Streptococcus pneumoniae sair índice Diplococo Gram positivo13 S = 14mm R > 15mm

índice sair Cápsula Polissacarídica Fator de Virulência Inibição da fagocitose Sorotipagem Importância epidemiológica Vigilância laboratorial Tipos mais freqüentes Variáveis: tempo região geográfica grupos etários diferentes infecções sorotipos versus R à penicilina

Resistência do Pneumococo a Penicilina sair índice Natureza cromossômica Aquisição transformação / mutação Mecanismo de R alteração “PBPs: PBP 2b” PBPs enzimas envolvidas na síntese da parede bacteriana Característica da R progressiva / aditiva anel beta-lactâmico

Métodos para Sensibilidade Antimicrobiana de Pneumococo sair índice Difusão em disco: qualitativo; S, RI, RA CIM microdiluição em caldo: quantitativo; _ ug/ml CIM E-test: quantitativo; _ug/ml Técnica: Meio de cultura Inóculo Semeadura Discos Incubação Leitura Cuidados em cada item !!!

índice sair R a PEN: NCCLS Sensibilidade a Pen: CIM <=0,06 ug/ml (S) Infecção pela cepa S pode ser adequadamente tratada com dosagem recomendada do antibiótico. R Intermediária a Pen: CIM >= 0,1-1,0 ug/ml (RI) % de resposta pela infecção com cepa RI pode ser baixa; clinicamente pode ser usada em tecidos que a droga atinge alta concentração ou usada em alta dosagem. R Plena ou Alta R a Pen: CIM >= 2,0 ug/ml (RA) Cepa RA não é inibida pela concentração sistêmica da droga. R Total = RI + RA CLSI/NCCLS, 2005

disco de beta-lactâmicos Difusão em disco sair índice disco de beta-lactâmicos amoxicilin, ampicilina, cefaclor, cefepime, cefotaxime, ceftriaxone, cefuromine, imipenem, meropenem, etc Antibiograma Geral: Oxacilina (A) Eritromicina (A) Sulfa-trimetoprim (A) Clindamicina (B) Vancomicina (B) Levofloxacin (B) Cloranfenicol (B) Tetraciclina (B) Rifampicina (C) !!?? Oxacilina: Triagem – R à Penicilina disco (1ug): S >= 20mm R <=19mm Falso positivo A - inclusão rotina e reportado B – inclusão rotina; reportado qdo A for R C – alternativos ou complementares O – indicação clínica , não rotineiros (ex: cefal. 1o. e 2o.) NCCLS

Cuidados sair índice 9 discos em placa de 150 mm ou 4 discos em placa de 100 mm não usar discos vencidos placa de meio de cultura e discos em temperatura ambiente 15 minutos o inóculo na bancada antes da semeadura não mover os discos leitura da sulfa-trimetoprim : 80% da redução de crescimento Descartar hemólise Sulfa-Trimetoprim – 80% do crescimento CO ST Leitura

índice sair Isolados de líquor Categoria de interpretação CIM (ug/ml): Meningite Outros S I R S I R Penicilina (A) <=0,6 0,1-1,0 >=2,0 <=0,6 0,1-1,0 >=2,0 Cefalosporina 3o.geração (B) <=0,5 1,0 >=2,0 <=1,0 2,0 >=4,0 (cefotaxima / ceftriazona) Antibiograma: Oxacilina 1 ug Eritromicina Vancomicina CLSI, 2005

índice sair Isolados de líquor Isolados de meningite CIM PenCIM Cefalosporina 3o.g Vancomicina Meropenem (?) Não reportar: Cefalosporina 1o.g Clindamicina Fluorquinolonas Macrolídeos Tetraciclina Isolados invasivos outros CIM Pen CIM Cefalosporina 3o.g (critério meningite e não-meningite) Eritromicina Levofloxacin Sulfa-trimetoprim Vancomicina NCCLS

Fenótipos de R raros, não reportados ou erro técnico sair índice Fenótipos: R a vancomicina R a fluorquinolonas R a penicilina e R a cefalosporina 3o.G. CIM PEN < CIM cefalosporina 3o.G.: CIM PEN = S e CIM cefal.= I ou R Ação: checar contaminação e qualidade dos insumos repetir o teste e confirmar o resultado uso de outro método (E-test) salvar a cepa e enviar ao lab de referência NCCLS

CIM: E-test para Penicilina e Cefalosporina 3o.G. sair índice Método: igual à difusão em disco ATCC 49619: PEN: 0,25-1,0 (RI) CTX: 0,032-0,125 (S) Leitura até o final de crescimento descartando hemólise considerar a diluição acima qdo em leitura for no intervalo Usar lupa

Vigilância de Pneumococo no Brasil: Vigilância Laboratorial do S. pneumoniae Vigilância de Pneumococo no Brasil: 1993-2004 (6.300 cepas) sair índice Sangue 24,3 L.pleural 8,7 LCR 66,0 outros 1,0 Material Clínico (%) Diagnóstico Clínico (%) Pneumonia 19,0 Bacteriemia 1,7 Meningite 69,3 outros invasivos 10,0 (9% ign.) RR=2 AP=2 MA=3 CE=45 PA=29 AM=18 1 RN=29 22,5 PB=4 PE=535 AC=4 AL=43 5,3 SE=38 GO=318 MT=6 BA=705 57,4 ES=46 MS=4 MG=436 RJ=196 PR=553 SP=2905 14 SC=141 Região Geográfica (%) RS=177

índice sair R a PEN no Brasil: cepas invasivas % Ano 26,9 27,2 24,9 22,1 22,9 20,7 14,3 15,1 13,6 14,8 12,8 10,2 Ano

Sorotipos Prevalentes de S.pneumoniae Brasil doença invasiva sair índice % cepas Sorotipos 1 5 14 6B 18C 6A 3 23F 19F 9V 4 19A outros Período: 1993-2000 sorotipos incluídos na vacina 7-val conjugada J Infect Dis 2003; 187:1206-12

Cobertura estimada potencial da vacina conjugada 7-valente sair índice Cepas, % (4, 6A/B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) 90 74 70 68 69 62 54 50 46.7 38.6 37.7 34 31 30 10 0-6 m 7-24 m >2-<6 a 6-49 a > 50 a Faixa etária pneumonia (X) meningites () J Infect Dis 2003; 187:1206-12

índice sair Sorotipos associados a R à PEN 14 56,5 31,3 25,2 19A 6,1 0,1-1,0 ug/ml >2,0 ug/ml Sorotipo % R 0,1-1,0 ug/ml >2,0 ug/ml 14 56,5 31,3 25,2 19A 6,1 6,1 6B 15,6 15,6 19F 2,6 2,6 23F 12,2 11,3 0,8 9V 0,8 0,8 sorotipo associado à alta R clones de R a Pen * sorotipo não vacinal Sorotipos incluídos na vacina conjugada 7-valente: 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 19F