Engenharia Genética DRA. CRISTIANE SUELY MELO DE CARVALHO DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE BIOTECNOLOGIA CURSO: LICENCIATURA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

O que é engenharia genética  2  Constitui um conjunto de técnicas de análises moleculares que permitem estudos de caracterização, expressão e modificação do material genético (DNA e RNA) dos seres vivos.

SINÔNIMOS  Manipulação genética,  Clonagem de genes  Tecnologia do DNA recombinante  Modificação genética  Nova genética 3

FINALIDADES  Investigação básica - função e estrutura dos genes  Produção de proteínas  Produção de plantas e animais transgénicos  Diagnóstico e tratamento médico 4

Perspectiva histórica  Gregor Mendel inicia a “Era da Genética” com os estudos das características da descendência na ervilheira;  Thomas Hunt Morgan demonstra que os genes estão localizados nos cromossomas (Prémio Nobel da Medicina em 1933);  Karl Ereky, um engenheiro húngaro, usa pela primeira vez o termo Biotecnologia;  George Beadle e Edward Tatum demonstram que um gene produz uma proteína (Prémio Nobel da Medicina em 1958); 5

6  Har Khorana, Robert Holley e Marshall Nirenberg decifram o mecanismo que permite ao DNA ser traduzido em proteínas (Prémio Nobel em 1968).  1967 – Isolamento da enzima DNA ligase: esta enzima permite ligar dois fragmentos de DNA  Descoberta das enzimas de restrição por Herbert Boyer (isolou a enzima EcoRI de Escherichia coli).  Início da tecnologia do DNA recombinante. Paul Berg recombina DNA do vírus SV40 com DNA de Escherichia coli (Berg partilha o Prémio da Química com Water Gilbert e Fred Sanger em 1980) James Watson e Francis Crick propõem a dupla hélice como estrutura para a molécula de DNA (Prémio Nobel da Medicina em 1962, que partilham com Maurice Wilkins).

7  Walter Gilbert e Allan Maxam em Harvard e Fred Sanger em Cambrige desenvolvem paralelamente duas técnicas que permitem determinar a sequência exata de bases que fazem um gene (Sanger recebeu o Prémio Nobel em 1980, juntamente com Paul Berg).  Clonagem do primeiro gene humano  A bactéria E. coli é usada para produzir insulina na forma humana pelos cientistas da Genentech Stanley Cohen e Herbert Boyer fazem a primeira experiência de Engenharia Genética aplicada a um microrganismo, a bactéria Escherichia coli. Este foi considerado o primeiro organismo geneticamente modificado (OGM).

8  Primeira planta transgénica: uma variedade de tabaco em que um grupo de investigadores, na Bélgica, introduziu os genes de resistência ao antibiótico canamicina.  A Genentech torna-se na primeira empresa de Biotecnologia a lançar o seu próprio produto biofarmacêutico: a ProTropin uma hormona de crescimento para crianças com deficiências na hormona de crescimento.  Produção da primeira planta com gene de resistência a inseto A insulina humana, a Humulin, torna-se no primeiro medicamento geneticamente modificado aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), nos EUA. Cerca de 5% dos diabéticos eram alérgicos à insulina de porco, anteriormente utilizada.

9  Surge a primeira planta tolerante a um herbicida total  Primeiro cereal transgénico: o milho  Início do Projeto de sequenciamento do Genoma Humano  Primeira ovelha transgénica (Tracey). Contém nserido um gene humano que lhe permite secretar no leite o inibidor da alfa-1 proteinase humana, uma glicoproteína importante no tratamento do enfisema pulmonar.  Primeira utilização de terapia génica para tratar umpaciente humano A Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) é concebida por Kary Mullis (Prémio Nobel da Química em 1993).

10  Pela primeira vez ocorre uma autorização (da FDA - EUA) para a cultura comercial de um alimento geneticamente modificado: o Flavr Savr (Calgen). Um tomate de vida prolongada com amadurecimento tardio, por evitar a produção de uma enzima envolvida no processo de senescência.  Nascimento do primeiro mamífero clonado a partir de células adultas: a ovelha Dolly.  Primeira planta transgénica com gene humano: o tabaco produtor de proteína c humana, uma enzima (protease) que desempenha um papel crítico no mecanismo anti-coagulação naturalmente presente nas células Aprovação (EUA) de uma hormona de crescimento bovina que aumenta a produção leiteira

11  Sequenciamento do genoma de Drosophila, a mosquinha da fruta.  Sequenciamento do genoma humano parcialmente completa  A área total plantada com plantas transgénicas no mundo inteiro é de 44,2 milhões de hectares (quatro vezes a área de Portugal).  Sequenciamento completa do genoma humano. Para grande surpresa da comunidade científica, só tem cerca de genes, muitos menos do que o arroz (45 000) ou o milho (50 000) Construção do primeiro cromossomo humano artificial, que potencialmente pode vir a ser utilizado na terapia génica

Engenharia genética MELHORAMENTO TRADICIONAL 12 MELHORAMENTO ATRAVÉS DA ENGENHARIA GENÉTICA

Engenharia Genética  Não se limita a organismos de uma mesma espécie;  A compatibilidade sexual torna-se irrelevante;  Permite modificações em uma única geração, o que antes levaria dezenas ou centenas de gerações 13

FERRAMENTAS plasmídeos (vetores) 14 Enzima de restrição DNA bactéria Doadores de DNA

Ferramentas Plasmídeos  Moléculas de DNA circulares que se replicam independentemente do cromossomo 15

PLASMÍDIOS E VETOR DE CLONAGEM 16 ocorrem naturalmente em algumas bactérias; são moléculas de DNA dupla fita e circular; muitas vezes carregam genes para resistência a antibióticos; replicação independente da replicação cromossômica (apresentam uma origem de replicação independente).

Plasmídeos  os plasmídeos possuem genes para a própria replicação, independentemente do “cromossomo” bacteriano;  não são essenciais para a sobrevivência da célula, em condições ambientais normais, podendo ser perdidos sem causar a morte celular. 17

Plasmídeos  eles podem conferir, propriedades essenciais à sobrevivência da bactéria  A sua replicação independente está associada a: - Origem de replicação - Genes de resistência aos antibióticos - devem apresentar múltiplos sítios de clonagem (polilinker) 18

Plasmídeos  Na Engenharia Genética, os plasmídeos são utilizados como vetores de clonagem, transportando genes, ou fragmentos de um DNA a ser clonado para dentro da célula hospedeira.  Os plasmídeos podem ser modificados para carregar novos genes.  O plasmídeo bacteriano possui a capacidade de inserir um fragmento de DNA externo ao seu próprio genoma.  Essa técnica consiste na formação de DNA recombinante. 19

Plasmídeos  A partir do DNA recombinante, os plasmídeos são usados para multiplicar ou expressar genes de interesse.  Outro uso importante é a produção de grandes quantidades de proteínas.  Neste caso, cultiva-se as bactérias que contém plasmídeos, onde são inseridos os genes que codificam a proteína que se pretende produzir.  Os plasmídeos também são vetores de clonagem.  Para isso, eles são modificados para incorporar genes com as características desejadas. 20

Plasmídeo 21 Origem de replicação Genes para resistência a antibióticos Permite que a célula hospedeira cresça em meio seletivo Múltiplos sítios de clonagem Permite a inserção de DNA exógeno

Primeiro plasmídeo artificial  pBR322  Tem sido um dos mais utilizados vetores de clonagem em E.coli.  Ele foi construído em 1977 e seu nome deriva de:  p (plasmídeo)  BR - Bolivar e Rodrigues, pesquisadores mexicanos, que o construiu 22

Primeiro plasmídeo artificial  possui 4361 pares de bases  origem de replicação (ori)  apresenta o gene amp R, que codifica a proteína de resistência a ampicilina e o gene tet R, que codifica a proteína de resistência à tetraciclina. 23

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Enzimas de Restrição  São encontradas nas bactérias e são utilizadas para cortar o DNA exógeno que possa penetrar em seu citoplasma  Reconhecem e cortam o DNA em pontos específicos  geralmente em sequências e 4 a 8 pares de bases, chamados palíndromos 25

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27 Nomenclatura Nome específico do organismo: 1a letra o gênero + 2 letras espécie = 3 letras próximo letra da identificação da cepa numeral romano indica ordem de identificação Escherichia coli = Eco R I Haemophilus influenza = Hin d III EcoR I Escherichia gênero espécie coli cepa RY 13 Ordem de descoberta 1º enzima a ser descoberta nesta bactéria

28 A descoberta das enzimas de restrição revolucionou a biologia molecular, pois possibilitou montar moléculas de DNA recombinantes e manipulá-las com extrema precisão.

Enzimas de Restrição: Tipos de Cortes  Clivagem no eixo de simetria – Corte abrupto (moléculas com extremidades abruptas) 29

Enzimas de Restrição: Tipos de Cortes  Clivagem simétricamente situada ao redor do eixo de simetria - Moléculas com extremidades coesivas 30

31 Clivagem Extremidades coesivas

32 OUTROS TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO