UBA III – Biologia Molecular Aula prática 2 2012/2013 Maria José Correia mariacorrei@gmail.com

Aplicações biotecnológicas das enzimas de restrição Sumário P2: Aplicações biotecnológicas das enzimas de restrição Eletroforese em gel de agarose Avaliação do padrão de restrição obtido pela digestão de DNA λ com as enzimas PstI, EcoRI e HindIII. 11/10/2013

Enzimas de restrição – ferramentas básicas em biologia molecular Tecnologia do DNA recombinante/ clonagem de genes Farmacologia Biotecnologia em processos industriais Fingerprinting de DNA Testes de paternidade Investigações criminais e outras aplicações forenses Manipulação de produtos transgénicos Incremento valor comercial de espécies Terapia génica transferência direta de genes em humanos com fim terapêutico 11/10/2013

Eletroforese em gel de agarose Separação de diferentes fragmentos de DNA em função da sua mobilidade num campo elétrico Fatores que influenciam a migração de DNA em gel Peso molecular Conformação do DNA Concentração de agarose Voltagem aplicada Composição do tampão de eletroforese http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php 11/10/2013 4

Eletroforese: preparação do gel de agarose Preparar uma solução de agarose em tampão TAE (1x) com concentração final de 1% (m/v). Aquecer a mistura em microondas até toda a agarose se ter dissolvido. Montar o suporte do gel na respetiva base de preparação do gel. Colocar o pente formador de poços na posição correta. Verter a agarose no suporte eliminando bolhas de ar que se tenham formado e deixar solidificar à temperatura ambiente. Retirar o pente cuidadosamente para não danificar os poços. Colocar o suporte na tina de eletroforese, de modo a que os poços estejam do lado do elétrodo negativo, e adicionar tampão TAE(1x) 11/10/2013 5

Electroforese: preparação das amostras Adicionar tampão de carga às reações de digestão (L, P, E e N) este vai conferir densidade à amostra, facilitando a sua aplicação nos poços Aplicar as amostras nos respetivos poços com uma micropipeta, evitando a contaminação dos poços adjacentes. Reservar um dos poços para aplicar marcador de pesos moleculares (para referência) Colocar a tampa na tina e verificar se a migração das amostras se dá no sentido cátodo-ânodo (preto-vermelho). Estabelecer a corrida a 100V durante 30 minutos. Depois da corrida, desligar a tina e retirar o gel e colocá-lo numa tina com corante. Lavar o gel com água (40-55ºC) Examinar os resultados. 11/10/2013 6

Registo e análise dos resultados Medir a distância “poço – banda” registar valores na tabela DNA λ PstI EcoRI HindIII x y x y 11/10/2013 7