Determinação de cátions em água de coco ELETROFORESE CAPILAR Determinação de cátions em água de coco

ELETROFORESE É um método de separação baseado na migração diferenciada de espécies iônicas ou ionizáveis através da aplicação de um campo elétrico. Desenvolvida por Anne Tiselius em 1930 e utilizada para estudo de proteínas em soro sangüíneo. MEIOS: PAPEL, AMIDO, AGAROSE, ACETATO DE CELULOSE, GEL DE POLIACRILAMIDA, etc

Comparação entre íons de mesma carga e de mesmo tamanho BASES PARA A SEPARAÇÃO A velocidade de migração de uma dada espécie depende da sua carga e do seu tamanho. As separações são baseadas nas diferenças das relações carga/tamanho dos vários analitos presentes em uma amostra. Comparação entre íons de mesma carga e de mesmo tamanho

Pode ser reescrita como Velocidade de Migração (cm s-1) v = e E Campo elétrico (V cm-1) Mobilidade eletroforética (cm2 V-1 s-1) Se duas espécies diferirem na carga ou nas forças de atrito, elas se separarão ao se moverem através do tampão sob a ação do campo elétrico. Potencial aplicado Pode ser reescrita como v = e V L Comprimento

CARACTERÍSTICAS DOS CAPILARES Usualmente, sílica fundida (-SiOH) recoberta de poliimida dimensões 15 a 100 µm de diâmetro interno 50 a 100 cm de comprimento boa resistência mecânica (devido à poliimida) alta resistência elétrica do eletrólito contido (permite campo elétrico de 100 a 500 V/cm) boa dissipação de calor (razão área/volume alta), necessária por causa do efeito Joule separações de alta eficiência (105 pratos teóricos) pequeno consumo de amostra (1 a 10 nL) e de tampão

SISTEMA PARA ELETROFORESE CAPILAR FONTE DE ALTA TENSÃO DETECTOR ELETRODO CAPILAR RESERVATÓRIO PARA O ELETRÓLITO DISPOSITIVO PARA CONTROLE DE TEMPERATURA CAIXA DE ACRÍLICO

FUNCIONAMENTO DA CE - +

++ - + -- Amostra Injeção da amostra Tampão

- + ++ -- Aplicação do potencial Tampão Tampão

- + ++ -- Processo de separação Tampão Tampão

+ ++ - -- - + Processo de separação Tampão Tampão

- + + ++ - -- Processo de separação Tampão Tampão

- + + ++ - -- Processo de separação Tampão Tampão

TIPOS DE INJEÇÃO Injeção da amostra Pressão Eletrocinética

INJEÇÃO POR PRESSÃO x ELETROCINÉTICA Não discrimina quanto à mobilidade do íon. Injeção mais representativa da amostra. Eletrocinética Discrimina a injeção de quantidades maiores de íons com maior mobilidade

FLUXO ELETROOSMÓTICO

V total = V eletroosmótica + V eletroforética ++ + - - - + - Veletroosmótica V total = V eletroosmótica + V eletroforética

MODOS DE DETECÇÃO LIMITES DE DETECÇÃO TÍPICOS, mol/L SISTEMAS DE DETECÇÃO MODOS DE DETECÇÃO LIMITES DE DETECÇÃO TÍPICOS, mol/L ABSORBÂNCIA direta 10-5 - 10-6 indireta 10-4 - 10-5 FLUORESCÊNCIA direta (lâmpada) 10-7 - 10-8 direta (laser) 10-9 - 10-12 indireta 10-6 - 10-7 RAMAN 10-6 - 10-7 ÍNDICE DE REFRAÇÃO direto (laser) 10-5 - 10-6 CONDUTIVIDADE 10-5 - 10-6 AMPEROMETRIA 10-8 - 10-9 ESPECTROMETRIA DE 10-4 - 10-9 MASSAS RADIOMETRIA 10-9 - 10-11

PREPARO DOS PADRÕES Preparar, por diluição apropriada a partir de soluções estoque 1000 µmol L-1, 1,00 mL de soluções padrão contendo as seguintes concentrações das espécies K+ Ca2+ Mg2+ Na+ Li+ Padrão 1 50 10 Padrão 2 100 20 Padrão 3 200 40 Padrão 4 250 Padrão 5 300 60 * Concentrações em µmol L-1

PREPARO DA AMOSTRA Em um vial de 1,5 ml adicionar 5 µL da amostra de água de coco, 75 µL de uma solução 1 mM em Li+ e completar o volume para 1,5 ml. Injetar a amostra de água de coco e obter o eletroferograma.

ESTUDO DE PARÂMETROS INSTRUMENTAIS Com a solução padrão 3, estabelecer o efeito das seguintes variáveis: 1. Tipo de injeção (Hidrodinâmica e eletrocinética) 2. Tempo de injeção 3. Tensão aplicada ( 10, 15, 20, 25 e 30 kV )

DETERMINAÇÃO DE CÁTIONS EM ÁGUA DE COCO Tampão de corrida: MES (30 mM) , Histidina (30 mM), pH 6. Voltagem: 25 kV Injeção Hidrodinâmica: 10cm/10s Capilar de Sílica fundida: 60cm e 75 mm de diâmetro interno Padrão Interno: 50 µM Li+ Eletroferograma de uma solução padrão de potássio (1), bário (2), cálcio (3), sódio (4), magnésio (5) e lítio (6).

CURVA DE REFERÊNCIA

aplicação de vácuo na extremidade do detector INJEÇÃO POR PRESSÃO Diferença de pressão h elevação da extremidade P pressurização da amostra vácuo aplicação de vácuo na extremidade do detector

INJEÇÃO ELETROCINÉTICA Um potencial é aplicado, por um tempo determinado, fazendo com que a amostra penetre no capilar através de um processo que combina a migração iônica e o fluxo eletroosmótico +