Prof.Doutor José Cabeda Estudos de citocinas Prof.Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Estudos de citocinas Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos fluidos biológicos A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é caracteristica de situações patológicas De estadios de situações patológicas As citoquinas podem ser estudadas por: Imunoensaios (ELISA, RIA) Bioensaios Citometria Métodos moleculares Prof. Doutor José Cabeda

Detecção de citoquinas: ELISA Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Bioensaios Uso de uma linha celular que responde à presença de uma citocina Cultura da linha celular na presença e na ausência de fluido a testar, e na presença da citocina recombinante. A medida da actividade celular é indicadora da presença/ausência de citocina Tipos de bioensaios (actividade celular medida) Actividade citotoxica Proliferação Função celular específica Quantidade de uma proteína induzida Prof. Doutor José Cabeda

Detecção de citoquinas:Bioensaios Activation of M in vitro Test for effect on other cells Cytokine secretion +/- Remove cytokine containing supernatant Which cytokine? Prof. Doutor José Cabeda

Especificidade dos bioensaios Test for a characteristic effect on other cells e.g. interleukin-1 Induces proliferation in thymocytes Include an antibody that blocks interleukin-1 + + IL-1 absent - IL-1 present Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Citometria de fluxo Estimular as células Mitogénio Ag+coestimuladores (a-CD28+ a-CD49d) Bloquear a secreção de citoquinas (brefeldin –BfA ou monensin) Lisar os eritrócitos e fixar Permeabilizar as células Marcar com anticorpo Analisar Prof. Doutor José Cabeda

Detecção de IFN-g por citometria Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Ensaios Moleculares Prof. Doutor José Cabeda

Estudo de doenças Auto-imunes Doenças Autoimunes endócrinas Prof.Doutor José Cabeda

Doenças Autoimunes endócrinas Tiroidite Crónica (Doença de Hashimoto) Doença de Graves Diabete Melitus dependente de Insulina Doença da Addison Prof. Doutor José Cabeda

Doenças Autoimunes endócrinas Autoantigénios Peroxidase da Tiroide (TPO) Antigénios Adrenais (Doença de Addison) Ovario, Testiculos, Placenta Antigénios da paratiróide Células parietais gástricas TSH-R Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Diabetes Mellitus Causada pela destruição das células beta do pâncreas, mediada por células T Estudo da função celular T não é prática Presença de Autoanticorpos é marcador da doença Auto-anticorpos resultam da libertação de antigénios das células beta, devido à sua destruição Mediada pela presença de antigénio. Logo diminui com a evolução da doença Testados por ImunoFluorescência, RIA ou ELISA Prof. Doutor José Cabeda

Auto-antigénios na IDDM Anti células beta = Islet cell antibodies (ICA) Existem em 70-80% dos doentes diagnosticados de novo Descarboxylase do ácido glutâmico (GAD) Bandas de 64Kd e 50Kd Insulinoma Antigen (40 e 37Kd) IA-2 IA-2b GLIMA – 38 Kd (só numa minoria de doentes) Anti insulina (IAA) Existem em 50% dos doentes diagnosticados de novo Quanto maior a variedade de auto-anticorpos, maior a probabilidade de o doente possuir IDDM Prof. Doutor José Cabeda

Auto-antigénios na IDDM Prof. Doutor José Cabeda

Estudo de doenças Auto-imunes Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso Prof.Doutor José Cabeda

Doenças Autoimunes do Sistema Nervoso Bloqueio da transmissão colinérgica periférica por auto-anticorpos Miastenia Gravis Presença de anticorpos anti-receptor da acetilcolina na membrana pós-sináptica do musculo Lambert-Eaton Myastenic Syndrome (LES) Presença de anticorpos anti canal de cálcio regulado pela voltagem, que regula a libertação do transmissor no terminal nervoso do músculo Prof. Doutor José Cabeda

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Estudo de doenças Auto-imunes Anemia Hemolitica Autoimune Prof.Doutor José Cabeda

Anemias Hemoliticas autoimunes Prof. Doutor José Cabeda

Anemias Hemoliticas autoimunes: Técnicas diagnósticas laboratoriais Direct Antiglobulin Test (DAT) Demonstra o “coating” dos RBC com Ab in vivo Usado para investigar : Anemia Hemolitica Autoimune (AIHA) Hemólise induzida por drogas Doença Hemolitica do recém-nascido Reacção aloimune á transfusão Em WAMA (worm) IgG liga RBC de modo estável Em CAD (cold) IgM liga RBC na circulação periférica, activando o complemento (C3), libertando-se a IgM quando a circulação atinge zonas mais quentes Em PCM (semelhante ao CAD mas com IgG sangue coag. Activ. complemento  falsos positivos Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda DAT: procedimento Colher sangue em EDTA (previne activ.complemento) Preparar RBC (2-4%) em PBS 1 gota RBC em 3 tubos (aIgG, aC3b/C3d, e albumina como controlo) Lavar 4 vezes com PBS (spin 1 min, 3400rpm) Adicionar 2 gotas de aIgG, aC3b/C3d, e 6% albumina Misturar e spin aIgG 15’’-3400rpm Ressuspender suavemente e observar macroscópicamente e microscópicamente para a presença de aglutinação Incubar 5 min-RT os restantes tubos Repetir 6 e 7 para os restantes tubos Adicionar celulas indicadoras (RBC revestidas com o respectivo antigénio) a cada tubo negativo Repetir passos 6 e 7, descartar tubos com resultados negativos pós passo 10 Prof. Doutor José Cabeda

Eluição de anticorpos de RBC Lavar RBC com PBS (remove proteínas não ligadas especificamente) Ressupender RBC em solução de glicina a baixo pH (promove a dissociação dos anticorpos) Centrifugar Recolher o sobrenadante enriquecido em anticorpos Neutralizar o sobrenadante com solução tamponada Prof. Doutor José Cabeda

Determinação de amplitude térmica de auto-anticorpos Cold reactive Ab reagem a 0-4ºC Anticorpos patogénicos reagem a cerca de 30ºC Colher e manter amostra a 37ºC Spin 3400rpm-1min Incubar 5’ a 37ºC 1 gota RBC 4% a 37ºC + 2 gotas soro/plasma a 37ºC Agitar; incubar 1 hora a 37ºC Spin 15’’-3400rpm e examinar macroscópicamente Repetir 5 e 6 a 30ºC Repetir 5 e 6 a 22ºC Pos a 30 e 22ºC  Ig patológicas Pos só a 22ºC Cold aglutinin A reactividade pode ser melhorada adicionando 30% BSA Prof. Doutor José Cabeda

Indirect Antiglobulin Test (IAT): (Antibody screen for RBC-Ab) Routine pre-transfusion test Soro incubado com 2 RBC grupo O comerciais e observados para aglutinação em 2 fases: 37ºC com agente “enhancer”* Após adição de a-IgG (reagente coombs) Se pos. O soro é testado com um painel mais alargado de RBC (8-10) para identificar a especificidade, e excluir os falsos positivios devido a alo-anticorpos WAIHA geralmente pan-RBC * BSA, Low Ionic strenght Saline (LISS), LISS com PEG ou polybrene, ou RBC tratados enzimaticamente) Prof. Doutor José Cabeda

Quantificação de alergénios Estudo de Alergias Quantificação de alergénios Prof.Doutor José Cabeda

Prof.Doutor José Cabeda Estudo de Alergias Estudos in-vivo Prof.Doutor José Cabeda

Quantificação de Alergénios Skin testing Protein content Quantificação de alergénios individuais (RIA,ELISA, etc) Imunoelectroforese PAGE Imunobloting Inhibition immunoassays Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Skin testing Para controlar a possibilidade de choque séptico Médico disponível em SOS Garrote disponível em SOS 1 mg epinefrina disponível em SOS Seringa hipodérmica com 100 mL alergénio Injecção de 20-50 mL, cerca de 3mm diâmetro Observação aos 15 min Medir dois diâmetros e calcular média Nova observação aos 30 min Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Skin testing Prof. Doutor José Cabeda

Prof.Doutor José Cabeda Estudo de Alergias Testes Laboratoriais Prof.Doutor José Cabeda

Testes laboratoriais para estudo de alergias Determinação de IgE total Determinação de IgE específica para um alergénio Screening multialergénico Imunoblotting com alergénios Medida de alergénios caseiros Skin testing Prof. Doutor José Cabeda

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Determinação de IgE total Captura com aIgE conjugada com suporte sólido Lavar Reagir com aIgE marcada Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) Prof. Doutor José Cabeda

Determinação de IgE específica para um alergénio Alergénio ligado a matriz sólida Adicionar soro doente Incubar e lavar Reagir com aIgE marcada Lavar Detectar a marcação (radioactividade ou actividade enzimática) Prof. Doutor José Cabeda

Multiple Alergen Screens Conjugar multiplos alergénios a uma matriz sólida Ex: Mistura de árvores Mistura de relvas Mistura de sementes Dermatofagoides farinae/pteromyssinus dust mites Pelo de cão e gato Etc... Prof. Doutor José Cabeda

Specific IgE Inhibition immunoassays Reconstituir o alergénio inibitório em PBS em diluições sucessivas Usar PBS como 0% inibição Adicionar inibidor em diferentes diluições ao soro do doente e incubar 2 horas com agitação Alergénio ligado a suporte sólido Fazer um ensaio de detecção de IgE específica Calcular a % inibição para cada diluição do inibidor Fazer um plot da inibição em função da concentração de inibidor Prof. Doutor José Cabeda

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