Proteômica Cromatografia Prof. Dr. Luciano Pinto

Cromatografia Chroma + graphein = cor + escrita -1903: Mikhail Sémionovitch Tswett (1872-1919) Chroma + graphein = cor + escrita

Cromatografia em papel Definição Método fisico-químico de separação de substâncias Presença de duas fases: Estacionária e móvel Separação ocorre devido a diferença de interação entre as substâncias e as fases Podendo ser uma analise qualitativa e/ou quantitativa Cromatografia em papel

Tipos de cromatografia

Cromatografia por exclusão molecular gel filtração A fase estacionária (matriz) consiste num gel com poros de diferentes tamanhos Proteínas de menor massa percorreram o ‘caminho’ dos poros Separa moléculas de diferentes tamanhos Resina usada – SEPHADEX, SUPERDEX – polímero de glicose- gel formado por esferas com poros Proteínas maiores são “excluídas” saindo primeiro na coluna

Gel Filtração

Característica da Matriz Superdex

Típica cromatografia de gel filtração

Cromatografia de afinidade • Resina usada AGAROSE- polímero de açucares de algas ao qual se liga um composto pelo qual a proteína tenha afinidade – enzima - o ligante é o seu substrato; – anticorpo - o ligante é o antígeno; – receptor de hormônio - ligante é o hormônio; • É a mais específica de todas.

Tipo de cromatografia de afinidade Pode ter o antígeno ligado Pode ter o anticorpo ligado

Cromatografia de troca iônica • Resina usada - CELULOSE ligada covalentemente a grupos com carga positiva ou negativa – carboximetilcelulose (- negativa) – dietilaminoetilcelulose (+ positiva) • Proteínas com a mesma carga da resina saem primeiro da coluna Moléculas carregadas ligam-se a grupos de carga oposta que se situam na matriz Remoção das proteínas que se ligaram à matriz é feita alterando as características do meio

Troca iônica: adsorção das moléculas

Troca iônica : eluição das moléculas

Troca iônica: eluição das moléculas e equilíbrio da coluna

Análise em escala laboratorial- pequenas purificações Cromatógrafos Análise em escala laboratorial- pequenas purificações

Cromatógrafos

Cromatógrafos

Colunas de cromatografia

Purificação seqüencial: Típica Aplicação Captura e purificação de: Proteínas, ex.: Anticorpos monoclonais Sangue/ fatores do plasma Proteínas recombinantes Peptídeos Polissacarídeos Oligonucleotídeos Vírus Diferentes tipos de colunas em linha