Polymerase chain reaction Reação de polimerização em cadeia Ou Polimerização em cadeia do DNA PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.

Breve Histórico Técnica “inventada” em 1985 por Kary B. Mullis A técnica já existia, entretanto, a DNA polimerase utilizada (E. coli) era destruída durante os ciclos de aquecimento e era necessário adição consecutiva a cada novo ciclo Foi o primeiro a sugerir a utilização de uma DNA Polimerase “termoestável”

DNA Polimerase Termoestável 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC

Thomas D. Brock no lago do “Yellowstone National Park” de onde foi isolado o Thermus aquaticus

• Várias enzimas isoladas desse microorganismo incluindo a primeira DNA polimerase termoestável – Taq DNA polimerase (1976)

Todas as DNA polimerases requerem: • Polimerização: 5’ 3’ Todas as DNA polimerases requerem: Primer de oligonucleotídeo Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) Cátion divalente -usualmente Mg2+ DNA molde http://www.youtube.com/watch?v=QVeVIM1yRMU

PCR requer 7 componentes essenciais: DNA polimerase termoestável Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA (primers) Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) Cátion divalente: toda DNA polimerase Requer cátion divalente, usualmente Mg2+ Tampão para manter o pH Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl) DNA molde

A TÉCNICA DE PCR

Virtualmente, qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR. A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers). Oligonucleotídeos com 17 “mers” são usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, tal como o genoma humano. O pareamento dos “primers” com a seqüência alvo na template se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, obedecendo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick: A T C G

PCR é um processo interativo, consistindo de três elementos: Desnaturação do DNA molde (template) por aquecimento Pareamento dos primers à seqüência alvo fita simples Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável

1. Desnaturação: 94ºC – 96ºC Separa a dupla fita do template em duas fitas simples 2. Pareamento: 37ºC – 65ºC Primers ligam-se em locais específicos do DNA molde 3. Extensão: 72ºC DNA polimerase usa os dNTPs adicionando-os a nova fita de acordo com a regra de pareamento – polimerização.

Marcador para sequencia desejada SYBR Green fluoresce apenas quando está ligado ao DNA

Primers: A concentração ótima de “primer” é entre 0,1 e 0,5 mM Ambos os membros do par devem ser usados na mesma concentração. Excesso de “primers” induz aparecimento de produtos inespecíficos e formação de dímeros de “primers”. http://www.youtube.com/watch?v=8-dsnlNsCao