Genoma funcional: identificar genes diferencialmente expressos Alguns fatos que afetam a eficiência dos métodos em identificar esses genes 15 mil a 30 mil diferentes RNAs População de RNA em uma célula >100 000 moléculas de RNA Classe RNA abundantes: 1% dos genes = 50% da pop. de RNAs Classe de RNA raros: metade dos genes = 1% pop. de RNAs
Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos Limitações microarrays: Genes pouco expressos não são detectados Difícil separação da contribuição de diferentes isoformas de um mesmo gene Outros métodos Subtração de bibliotecas PCR supressivo mRNA fingerprint cDNA-AFLP CAP Trapper
sistema utilizando biotina, streptavidina e partículas magnéticas Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos Subtração de bibliotecas de cDNA sistema utilizando biotina, streptavidina e partículas magnéticas Tester: biblioteca de cDNA aonde estão os genes que quero fisgar meu gene (gene induzido peloetileno:: tratamento com etileno) Driver: biblioteca de cDNA aonde não estão os genes que quero fisgar meu gene (genes não induzidos pelo etileno:: tratamento sem etileno)
Genoma funcional: outras metodologias para identificar genes diferencialmente expressos PCR supressivo
PCR supressivo
Sequência não forma est. pan em moléculas PCR supressivo Sequência não forma est. pan em moléculas maiores, só em menores
SUPRESSION PCR
com nucleotídeos marcados Differential RNA display AAAAAAAA Gene 1 2 dias TTTTTT Primer OligodT GCUAAAGCGA Primer decâmero randômico Reação de PCR com baixa temperatura de anelamento, com nucleotídeos marcados radioativamente AAAAAAAA Gene 2 TTTTTT Primer OligodT GCUAAAGCGA Primer decâmero randômico AAAAAAAA Gene 3 TTTTTT Primer OligodT GCUAAAGCGA Primer decâmero randômico GCUAAAGCGA TTTTTT Condição 1 Condição 2 Gel de poliacrilamida e uréia (sequenciamento) Gene mais expresso na condição 1 Gene mais expresso na condição 2 Gene somente expresso na condição 2
Criticismos Pouca capacidade para detectar RNA raramente expressos Banda do gel: mistura de cDNAs: 50-75% bandas = falsos positivos Artefatos: primers curtos e baixa temp. anelamento: amplificação inespecífica Limitada quantitividade: competição pelos primers por transcritos de diferentes abundâncias Primers curtos: semi-pareamento em outras regiões do mesmo gene:dif. Clones positivos podem ser o mesmo gene Fragmentos pequenos (150-400 bp) contendo principalmente região 3’ UTR: difícil identific. Modificações do método original Primers mais longos com programa com ciclo alterado Combinação com subtração Arbitrary primed PCR (RAP-PCR): dois primes curtos: probl. Falsos positivos Integração do protocolo para PCR de longa distância no Differential display (até 2Kb- LDD-PCR)
Ecotipos de A.thaliana: EcoR I+CC and Mse I+AAA). Ecotipos de A.thaliana: linhas 1 and 2.Columbia; linhas 3 and 4. Landsberg. Genótipo: Columbia, Usando primer EcoR I+AC e: Mse I primer+AA (lanes 1 and 2); Mse I primer+AAA (lanes 3 and 4). Introdução de um novo nucleotídeo Levou a amplificação de um outro subgrupo de cDNAs
Uso em larga escala do cDNA-AFLP Sinchronized tobacco cells ( 12 point into S and M→G1 transition were sampled. Exhaustive cDNA-AFLP: 360 AFLP primer combinationsÇ 18,000 AFLP tags About 10% exhibited a modulated cell cycle profileÇ 1150 AFLP tags Tobacco BY2 cells were synchronised in the G1→S transition phase using Majority of these AFLP tags either match genes of unknown function or represent novel sequences.