Controle do Crescimento Microbiano

1. Introdução 1.1. Quais os principais fatores limitantes para o crescimento microbiano? Temperatura pH Disponibilidade de H2O Disponibilidade de O2 1.2. Uso dos agentes de controle - estudos com microrganismos ou sua aplicação - evitar infecções - evitar a decomposição de materiais

Condições que Afetam a Atividade de um Agente de Controle Microbiano * tamanho da população * intensidade ou concentração do agente * tempo de exposição * temperatura do ambiente * natureza do meio: umidade, pH... * tipo de microrganismo**

Influência do Tamanho Inicial da População sobre a Efetividade de um Agente de Controle

Influência da concentração de Fenol sobre o crescimento de Escherichia coli Fenol a 35 °C Cortesia da Universidade de Cambridge

Influência da temperatura no crescimento de Escherichia coli exposta a Fenol Cortesia da Universidade de Cambridge

3. Tipos de Agentes de Controle e Mecanismos de ação 3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos - Esterilização pelo calor - Esterilização por radiação - Esterilização por filtração 3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos - Agentes químicos de uso externo (tópico) 3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo 3.3.1. Fármacos antimicrobianos sintéticos 3.3.2. Antibióticos 3.3.3. Fármacos antifúngicos 3.3.4. Fármacos antivirais

3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos 3.1.1. Calor Úmido * desnaturação de proteínas e enzimas a) Água fervente (100 ºC) - células vegetativas x esporos b) Sob pressão (autoclavagem) – 121 °C a 1,1 kg cm-2 - rápido aquecimento - grande penetração c) Pasteurização 1860: Louis Pasteur/vinho 62,8 ºC/30 min ou 72 ºC/15 s

Medida da Esterilização pelo Calor Efeito da temperatura na viabilidade de uma bactéria mesofílica Fonte: Madigan et al., 2004. Microbiologia de Brock

3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos 3.1.2. Calor Seco * Oxidação dos constituintes orgânicos * Menor eficiência que o calor úmido a) incineração: eliminação de contaminantes e cadáveres, esterilização da alça de platina b) forno de Pasteur * 160 ºC durante 2 h 3.1.3. Baixas Temperaturas * preservação de alimentos, drogas * inibição das reações metabólicas * formação de cristais de gelo (congelamento) * redução da água disponível

3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos 3.1.4. Radiações * Energia eletromagnética: raios cósmicos a ondas de rádio a) ionizante: raios gama Gamma radiation, also known as gamma rays (denoted as γ), is electromagnetic radiation of high frequency (very short wavelength). They are produced by high energy sub-atomic particle interactions in natural processes and man made mechanisms. These include electron-positron annihilation, neutral pion decay, fusion, fission, lightning strike, inverse Compton scattering and synchrotron radiation. Gamma ray production events range from production of a single gamma photon to explosive bursts that are the most powerful observed in the visible universe. Because gamma rays are a form of ionizing radiation, they pose a health hazard when absorbed by living tissue.

3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos 3.1.4. Radiações * Energia eletromagnética: raios cósmicos a ondas de rádio a) ionizante: raios gama, raios-X, feixes de elétrons: *ionização das moléculas ex. H2O OH* (hidroxil) + e- + H+ Poderoso oxidante * alto poder de penetração b) não ionizante: * luz ultravioleta: 136 a 400 nm (** 260 nm) * excita os elétrons produzindo vários tipos de reação: DNA (mais afetado) - dímeros de pirimidina * baixo poder de penetração

Sensibilidade de Microrganismos e de Funções Biológicas à Radiação Gray (Gy) é uma unidade do Sistema Internacional de medidas, que representa a quantidade de energia de radiação ionizante absorvida (ou dose) por unidade de massa, onde: 1 Gy = 1kg.m-2 s-2 O nome da unidade é em homenagem a Louis Harold Gray (1905–1965), um radiologista britânico.

3.1. Controle Antimicrobiano por Agentes Físicos 3.1.5. Filtração * Chamberland (1884): primeiro filtro bacteriológico de porcelana para água * Modernos: membranas de ésteres de celulose - poros uniformes - diâmetro variável - descartáveis * ex. filtros HEPA (high efficiency particulate air): acetato de celulose dobrado ao redor de folhas de alumínio - retém 99% da matéria particulada

Filtros HEPA Utilizados em Câmaras de Fluxo Laminar

Unidades de Membranas Filtrantes Descartáveis, Pré-Esterilizadas e Montadas Fonte: Madigan et al., 2004, 2010. Microbiologia de Brock

Filtros Microbiológicos Filtro de profundidade (Fibras de papel ou de borossilicato) Membrana Filtrante (Acetato de celulose, nitrocelulose ou polissulfona) Filtro Nucleoporo (Filmes de policarbonato) Fonte: Madigan et al., 2004. Microbiologia de Brock

Micrografia Eletrônica de Varredura de Bactérias e Algas Aquáticas Retidas em um Filtro Nucleopore Fonte: Madigan et al., 2004. Microbiologia de Brock

Agentes Químicos

3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos 3.2.1. Esterilizantes a) Óxido de etileno * ativo contra células vegetativas e endósporos * alta penetração, mas necessita longa exposição * líquido abaixo de 10,8ºC, acima disso é um gás * inativação das proteínas com H lábil (-SH, -NH) H2C-CH2 + R-SH R-S-CH2CH2O-H O (inativação) b) Alquilantes (alquilação de proteínas: cross-link) – radical livre, carbeno, etc. * -propionolactona * Glutaraldeído * Formaldeído (formol)

3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos 3.2.2. Desinfetantes a) Fenóis (ácido carbólico): primeiro agente químico usado para o controle microbiano * Joseph Lister (1865): efetivo agente antisséptico em hospitais * solução a 5% mata células vegetativas, mas não os endósporos Joseph Lister Fenol b) Álcoois * Etílico a 60-85%: mata células vegetativas * Metanol: mais eficiente porém muito tóxico * Desnaturação de proteínas * Dissolvem os lipídeos da membrana

3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos c) Halogênios: iodo, cloro, bromo * iodo e compostos relacionados: agente oxidante, combina-se com a tirosina, inativando proteínas * cloro: formação de ácido hipocloroso liberando radicais de oxigênio d) Metais pesados: chumbo, zinco, prata, cobre, mercúrio * combinam-se com proteínas, provocando sua inativação ex. SH S enzima + HgCl2 enzima Hg + 2HCl

3.2. Controle Antimicrobiano por Agentes Químicos e) Detergentes * desnaturação das membranas - Aniônicos: [C9H19COO]-Na+ (sabão) - Catiônicos: Cloreto de amônio - Não iônicos: octoxinol (etileno)

Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo

3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo - A maioria dos agentes físicos é muito drástica e a maioria dos agentes químicos é muito tóxica para uso interno em humanos - Mesmo antissépticos moderados podem ser aplicados somente sobre a pele Diferentes tipos de fármacos antimicrobianos são produzidos continuamente pela indústria farmacêutica - Os fármacos antimicrobianos são classificados de acordo com sua estrutura molecular, seu mecanismo de ação e seu espectro de atividade antimicrobiana - Categorias de fármacos antimicrobianos: Agentes sintéticos Antibióticos

3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo 3.3.1. Fármacos antimicrobianos sintéticos Salvarsan primeiro agente quimioterápico: composto orgânico com arsênio uso do arsênico para tratamento da sífilis: até 1900 (muito tóxico) Paul Erlich - Prêmio Nobel 1908 Paul Erlich Salvarsan Fonte: Madigan et al., 2004. Microbiologia de Brock

3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo 3.3.1. Fármacos antimicrobianos sintéticos Sulfonamidas * Gerhard Dogmagk da Bayer (1935) - teste com corantes orgânicos sintéticos contra estreptococos: Prontosil * Jacques Tréfouël (Sulfanilamida): análogo estrutural do PABA (ác. p-aminobenzóico) - PABA: coenzima para formação de ác. tetrafólico (síntese de timidina e aminoácidos) - Seres humanos não usam PABA, sintetizam viatmina B9 a partir do ác. fólico dos alimentos * 1945: milhares de derivados (SULFONAMIDAS) (c) Ácido fólico

3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo 3.3.2. Antibióticos - Definição: Agentes antimicrobianos produzidos por microrganismos (bactérias e fungos) exibindo função de inibir ou matar outros microrganismos Ganhadores do Premio Nobel em Fisiologia e Medicina de 1945 “Descoberta da Penicilina e seus efeitos curativos em várias doenças infeciosas" Sir Alexander Fleming Ernst B. Chain Sir Howard Florey

3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo 3.3.2. Antibióticos - Espectro de ação: * Largo espectro (ex: Tetraciclina) * Baixo espectro (ex: Vancomicina)

Produção e Utilização Anual de Antibióticos no Mundo * * * * * Antibióticos β-lactâmicos Fonte: Madigan et al., 2004. Microbiologia de Brock

Principais Agentes Antimicrobianos de Procariotos Antibióticos -lactâmicos: * Principais representantes: penicilinas e cefalosporinas * 50% dos antibióticos produzidos mundialmente * Produtores: Penicillium chrysogenum: penicilina Acremonium spp.: cefalosporina * Inibem a síntese de peptidoglicano (transpeptidação) * Provocam a liberação de autolisinas: digestão da parede já existente * Espectro: ativos contra bactérias Gram positivas * Aparecimento de resistência: produção de β-lactamases

Principais Agentes Antimicrobianos de Procariotos Antibióticos Aminoglicosídeos: * Aminoaçúcares unidos por ligações glicosídicas * Principal representante: Estreptomicina (produzida por Streptomyces griseus) * Ação: inibição da síntese de proteínas (ligação com a subunidade 30S) * Espectro: ativos contra G- e G+, usados clinicamente contra Gram negativos * Rápido aparecimento de cepas resistentes * Apenas 3% do total de antibióticos produzidos

Principais Agentes Antimicrobianos de Procariotos Antibióticos Macrolídeos: * Grande anel lactona conectado com açúcares * Principal representante: Eritromicina (produzida por Streptomyces erythreus) * Ação: inibição da síntese de proteínas - combina-se com a subunidade 50S ribossomal * Ativos contra bactérias Gram + e Gram - * Usado em substituição à penicilina para pacientes alérgicos Eritromicina Fonte: Madigan et al., 2010. Microbiologia de Brock

Mecanismos de Ação de Alguns dos Principais Agentes Antimicrobianos de Procariotos Síntese Protéica (inibidores de 50S) Eritromicicina (macrolídeo) Síntese Protéica (inibidores de 30S) * Principais alvos: - Parede celular - Membrana plasmática - Processos biossintéticos: síntese de proteínas síntese de ác. nucléicos Fonte: Madigan et al., 2010

3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo 3.3.3. Fármacos Antifúngicos * Apresentam problemas para o desenvolvimento de quimioterápicos * Muitos fármacos antifúngicos podem ser utilizados apenas em aplicações tópicas (superfície) * Alguns apresentam toxicidade seletiva: afetam estruturas ou processos metabólicos específicos dos fungos * Principais representantes: Polienos (Streptomyces nodosus; S. nursei) Azóis (fármacos sintéticos)

Mecanismos de Ação de Agentes Quimioterápicos Antifúngicos Fonte: Madigan et al., 2010. Microbiologia de Brock

3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo 3.3.3. Fármacos Antivirais Controle de vírus * a condição de parasita intracelular obrigatório - íntima ligação com as funções da célula hospedeira - dificuldade de controle a) Análogos de Nucleosídeos * AZT (Zidovudine): análogo estrutural da timidina - bloqueia a síntese de DNA intermediário dos retrovírus (transcriptase reversa) * Aciclovir: inibe o alongamento do ácido nucleico viral b) Neviparina: liga-se à transcriptase reversa, inibindo sua ação c) Rifamicina: inibe a RNA polimerase

3.3. Agentes Antimicrobianos Utilizados In vivo 3.3.3. Fármacos Antivirais Interferon: * substâncias antivirais produzidas por células animais * proteínas de baixo PM * inibem a multiplicação dos vírus por estimular a produção de proteínas antivirais * ligação a receptores de células não infectadas * específicos para cada tipo de célula e não de vírus * eficientes para vírus de baixa virulência * sua produção é induzida pela presença do vírus, pelo ácido nucleico viral ou pelo vírus inativado por radiação

Drogas Antivirais Criadas por Computador Drogas antivirais geradas por computador. Inibidores de proteases virais Fonte: Madigan et al., 2004. Microbiologia de Brock

Aparecimento de Resistência a Drogas Antimicrobianas em Alguns Patógenos Humanos * * * * Apresentam linhagens que não podem ser controladas com os fármacos atualmente conhecidos Fonte: Madigan et al., 2010. Microbiologia de Brock

Aparecimento de Resistência a Drogas Antimicrobianas Neisseria gonorrhoaea Surgimento de bactérias resistentes às drogas antimicrobianas. (a) relação entre o uso do antibiótico e a porcentagem de bactérias resistentes (b) porcentagem de casos relatados de gonorréia causada por linhagens resistente às drogas Fonte: Madigan et al., 2004. Microbiologia de Brock

Avaliação da Sensibilidade a Antibióticos por Métodos de Diluição Fonte: Madigan et al., 2004. Microbiologia de Brock

Teste de Difusão em Discos - Antibiograma Padrões definidos pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI) Fonte: Madigan et al., 2010