PCR em Tempo Real Isabela Fonseca 13/04/2010

PCR Convencional Método sensível Permite apenas a identificação da presença ou ausência da sequência alvo Não permite comparação entre diferentes reações já que há oscilações na eficiência de amplificação Leitura do tipo end-point - final da reação

Cinética da Reação de PCR P = quantidade de produto final n = número de ciclos E = eficiência da reação T = quantidade inicial de alvo (molde) Exemplo: n = 40 e E = 1 (100%) temos: P= T(2)40 = T x 1,099 x 1012

Cinética da Reação de PCR Curva Teórica Curva Real Acúmulo de inibidores Escassez de reagentes Perda da atividade da DNA polimerase

Fases da PCR 1 - Lag 2 - Exponential 3 - Linear 4 - Plateau

Fases da PCR 1 - Lag ou Baseline Início da reação. Log [DNA] Cycle # 1 - Lag ou Baseline Início da reação. No PCR em Tempo Real, compreende a fase da amplificação em que o equipamento não consegue detectar o sinal de fluorescência emitido.

Fases da PCR Log [DNA] Cycle # 2 - Exponencial ou Geométrica A quantidade de produto é dobrado a cada ciclo (assumindo uma E = 100%). Fase de maior especificidade e precisão. O tamanho depende da concentração e qualidade do ensaio.

Fases da PCR Log [DNA] Cycle # 3 - Linear Fase em que os componentes da reação são consumidos e começa a haver uma diminuição na “velocidade” da reação. Cai a eficiência da reação (<100%). Fase de maior variabilidade pois é dependente de vários fatores.

Fases da PCR Log [DNA] Cycle # 4 - Plateau Há pouca ou quase nenhuma formação de produto. Os componentes da reação começam a ficar escassos e há inibição enzimática pela formação de produto.

Leitura end point x Tempo Real Placa pipetada por um robô com mesma quantidade de alvo e mix em todos os wells Quantificação end point é imprecisa por depender da eficiência de cada reação. Detecção no início da fase exponencial permite uma quantificação altamente reprodutível.

Terminologia do PCR em Tempo Real Rn Rn- Rn+ Ct= Threshold Sample NTC (no template control) ∆Rn Baseline Threshold Ct: Cycle Threshold Rn (Normalized Reporter) ΔRn = (Rn+) - (Rn-)

Terminologia do PCR em Tempo Real Baseline - os ciclos iniciais da PCR nos quais há uma pequena alteração no sinal de fluorescência. A emissão está abaixo do nível de detecção do equipamento. A amplificação é exponencial. Normalmente é de 3 a 15.

Terminologia do PCR em Tempo Real Threshold - o desvio padrão médio de Rn para os ciclos iniciais da PCR, multiplicado por um fator ajustável. Deve ser ajustado na região inicial associada a um crescimento exponencial do produto da PCR.

Terminologia do PCR em Tempo Real Ct - o número do ciclo no qual a fluorescência passa o threshold. É inversamente proporcional a quantidade de alvo presente no início da reação. Ct =19,41

Terminologia do PCR em Tempo Real Referência passiva: é um fluoróforo que fornece um sinal de fluorescência interna o qual pode ser utilizado para normalizar o sinal do reporter dye. A normalização é necessária para corrigir flutuações de fluorescência causada por mudanças na concentração ou volume (evaporação e erros de pipetagem). Ex.: ROX.

Terminologia do PCR em Tempo Real Reporter dye - o fluoróforo que é emite fluorescência utilizada para indicar amplificação durante a PCR. Ex.: FAM, SYBR Green. 5' 6-FAM™

Terminologia do PCR em Tempo Real Quencher - o fluoróforo que reduz a fluorescência emitida pelo reporter dye. Ex.: TAMRA, MGB (não fluorescente). 3' TAMRATM

Terminologia do PCR em Tempo Real Rn: = Intensidade de Emissão do Reporter/ Intensidade de Emissão da Referência Passiva ΔRn = (Rn+) - (Rn-) Rn+: O valor Rn da reação contendo todos os componentes, incluindo o molde Rn-: O valor Rn de uma amostra não reagente. Pode ser obtido a partir dos ciclos iniciais ou de uma reação que não contenha nenhum molde.

Terminologia do PCR em Tempo Real Eficiência da Reação - é a taxa na qual o amplicon é gerado. Se a quantidade de amplicon dobrar a cada fase a eficiência da reação é 100%. Onde: E = eficiência da reação b = inclinação da curva Influenciada pela qualidade dos reagentes, montagem do experimento, tamanho , estrutura e conteúdo de GC do amplicom, presença de inibidores de PCR, qualidade da amostra e análise. Construída a partir de uma curva padrão. Valores ótimos de 90% a 110%, que corresponde a um valor de b entre -3,58 e -3,10).

Terminologia do PCR em Tempo Real Padrão - uma amostra de concentração conhecida utilizada para construir uma curva padrão. Controle endógeno ou referência ativa - o Ct gerado é utilizado para normalizar os dados experimentais. Ex. GAPDH, β-Actina e 18S rRNA. Controle Exógeno - RNA ou DNA conhecido inserido em cada amostra numa concentração conhecida. Ativa - Controle positivo interno (IPC) Utilizada para diferenciar verdadeiros alvos negativos da inibição do PCR. Calibrador - uma amostra utilizada como base para resultados comparativos.

Tipos de Quantificação Absoluta Determinação do número exato de moléculas. Relativa Análise comparativa do ácido nucleico alvo com o do controle interno ou do calibrador

Quantificação Absoluta Determinação do número exato de moléculas de ácido nucleico alvo. Utilizado para quantificar amostras desconhecidas interpolando suas quantidades a partir de uma curva padrão. Aplicações Quantificação de carga viral Transgênicos Terapia Gênica Detecção de Patógenos

Curva Padrão - QA É construída plotando-se no eixo X o log da quantidade inicial do número de cópias do alvo (quantidade conhecida) e no eixo Y plota-se o Ct. Cada reação é feita em duplicata ou triplicata. Obtêm-se uma equação da reta e obtêm-se os valores de R2 e X (quantidade desconhecida amostra). Valor ideal de R2 = 0,999

Curva Padrão - QA Normalmente é utilizado um plasmídio ou molécula de RNA transcrita in vitro como padrão. As concentrações devem ser medidas por espectrofotometria (A260) ou convertida ao número de cópias usando um padrão de peso molecular de DNA ou RNA. Deve ser executada por uma técnico bem treinado em pipetagem, já que os padrões serão diluídos a concentrações em torno de 106 a 1012 vezes. Os padrões diluídos devem ser estáveis.

Curva Padrão - Análise de Resultado

Quantificação Relativa Determina a quantidade de expressão de um gene alvo em uma determinada amostra relativa à outra de referência (tal como uma amostra controle não tratada - calibrador). Calibrador pode ser uma amostra não tratada ou, por exemplo, no tempo zero de um experimento. Fornece uma comparação acurada entre o nível inicial do alvo em cada amostra sem requerer o exato número de cópias. Deste modo, pode-se determinar o nível relativo do alvo na amostra sem necessidade de construir uma curva padrão. Aplicações Estudos de expressão gênica

Análise de Resultado - QR Cálculo: Fold-expression changes é calculado usando-se a equação 2−ΔΔCt, onde: ΔCt = (Ct alvo - Ct referência) ΔΔCT = ΔCt amostra - ΔCt calibrador

Análise de Resultado - QR Fold Change= 2ΔCt 212–6 = 64X menor na amostra

Sistemas de Detecção Baseados em: Corantes que se ligam ao DNA SYBR Green Primers fluorescentes Lux ™ primers - Invitrogen Amplifluor™ qPCR primers - Biosearch Technologies Plexor™ primer - Promega Scorpion® primers Sondas TaqMan® - Applied Biosystems Molecular Beacons - Public Health Research Institute - USA

SYBR Green Utiliza o corante SYBR Green que se intercala a molécula de DNA dupla-fita. Não se liga a DNA fita simples. Durante a PCR o SYBR Green liga-se aos amplicons formados. Com o aumento na produção de amplicons, a intensidade de fluorescência é proporcional à quantidade de produto gerado na reação

SYBR Green Vantagens Desvantagens Pode ser utilizado para monitorar a amplificação de qualquer sequência de DNA dupla-fita. Não é necessário sonda, o que reduz o custo do ensaio. Desvantagens Pode gerar sinais falso-positivos - liga-se a sequências não específicas de DNA dupla fita. Não permite reação multiplex.

SYBR Green

SYBR Green Curva de Dissociação

SYBR Green - Curva de Dissociação

Sistema TaqMan® Utilização de sondas marcadas, além dos primers, com fluorescência que utilizam a atividade nuclease 5’ da DNA polimerase. Uma sonda (oligonucleotídeo) é construída contendo um corante reporter fluorescente na extremidade 5’ e um corante quencher na extremidade 3’. Enquanto a sonda está intacta, a proximidade do quencher reduz a emissão de fluorescência pelo reporter. Se o alvo estiver presente na reação a sonda se anela logo após um dos primers e é clivada através da atividade da nuclease 5’ enquanto o primer é extendido. Quando o reporter se separa do quencher há um aumento na emissão de sinal do reporter.

Sistema TaqMan® Vantagens Desvantagem Ensaio mais específico porque há a necessidade de hibridização específica entre a sonda e o alvo para gerar sinal fluorescente. Podem ser feitas reações multiplex com reporters distintos e distinguíveis pelo equipamento. Reduz o tempo total da reação Desvantagem Necessidade de síntese de primers e sondas o que aumenta o custo do ensaio.

Sistema TaqMan®

Sistema TaqMan®

Sistema TaqMan®

Sistema TaqMan® TaqMan Fluorescent Dyes Quencher Reporter Q R Passive Reference ROX Reporter FAM TET JOE HEX VIC Quencher TAMRA NFQ +MGB Q R PR

Plataformas de Detecção - Applied Biosystems ABI 7700 ABI 5700 ABI 7000 ABI 7900HT ABI 7300 ABI 7500 7500 Fast Real-Time PCR System 7500 Real-Time PCR System

Plataformas de Detecção Roche LightCycler® 2.0 Real-Time PCR System LightCycler 480 System LightCycler® 1536 Real-Time PCR System BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR Detection System CFX384 Real-Time PCR Detection System MyiQ2 Two-Color Real-Time PCR Detection System MiniOpticon Real-Time PCR Detection System

ABI PRISM® Sistema Óptico Filter Wheel CCD Camera Lamp Excitation Filter 96-Well Plate Multi- Element Lens Dichroic Mirror Fresnel Lens Well Lenses Fold Mirror

Links Animações http://www.biosearchtech.com/flash/guides/formats_explained.html http://croptechnology.unl.edu/animationOut.cgi?anim_name=taqman.swf http://appliedbiosystems.cnpg.com/video/flatFiles/1088/index.aspx

Obrigada!!! Dúvidas???