Eletroforese de Proteínas em Gel de Poliacrilamida 1-Introdução 2-Determinação da Malha no Gel 3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE 4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE Edmar Vaz de Andrade

1-introduçao PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Poros (malha) com dimensões moleculares, onde a separação no gel ocorre de acordo com a filtração em gel e com mobilidade eletroforética das moléculas. Indicada para separação de: DNA Proteínas

2-Determinação da Malha no Gel Polímero formado pela reação entre Acri-Bis Monômeros acrilamida N, N’-metilenobisacrilamida Ligação cruzada Acri-Bis Acri-Bis: acrilamida ligada a N, N’-metilenobisacrilamida

2-Determinação da Malha no Gel A polimerização entre Acri-Bis é catalisada por radicais livres APS: persulfato de amônio. Se decompõe naturalmente formando radicais livres. TEMED: estabiliza os radicais livres formados a partir do APS.

2-Determinação da Malha no Gel A formação do polímero entre acrilamida ligada a N, N’-metilenobisacrilamida determina a dimensão dos poros formados (malha) no gel. Depende da quantidade de ligações cruzadas: Varia em função da concentração de acrilamida e N, N’-metilenobisacrilamida

3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE Desnaturação da proteína: Aquecimento a 100 °C β-mercaptoetanol: agente redutor SDS-PAGE SDS: dodecil sulfato de sódio. Detergente aniônico forte. Interage com a proteína de modo independente da seqüência primária (proporcional a massa molecular) 1 molécula de SDS para cada 2 resíduos de aminoácidos

3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE Desnaturação da proteína Ligaçao de SDS com a / proteína Efeito do SDS sobre as proteínas desnaturadas: Conformação linearizada Carga líquida negativa

Aparato para eletroforese em SDS-PAGE 3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE Gel separador Gel concentrador Aparato para eletroforese em SDS-PAGE

3-Eletroforese em condições desnaturantes SDS-PAGE

Coloração por azul brilhante de Coomassie 4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE Coloração por azul brilhante de Coomassie

Coloração por azul brilhante de Coomassie 4-Visualização das proteínas separadas por SDS-PAGE kDa 75 50 35 30 25 Quitinase de Crhomobacterium violaceum expressa em Escherichia coli Coloração por azul brilhante de Coomassie