Serial Analysis of Gene Expression - SAGE

Retomando por alto, a técnica a partir de mRNA sintetiza cDNA e deste isola tags que ao serem seqüenciados e contados conseguem representar a expressão dos genes no organismo. 2

Serial Analysis of Gene Expression - SAGE AAAAAA TTTTTT AAAAAA TTTTTT Clivagem com a enzima de ancoragem (AE) – Nla III Ligação às esferas de estreptoavidina AAAAAA TTTTTT GTAC Dividir e ligar os “linkers” (A+B) CATG AAAAAA TTTTTT CATG AAAAAA TTTTTT GTAC GTAC CATG CATG GTAC GTAC Clivar com a enzima para a produção das Tags (TE) Mme I - Gerar extremidades coesivas AGGYTGTACXXXXXXXXXXXXXXX TCCRACATGXXXXXXXXXXXXXXXXX TE AE Tag TCCRACATGXXXXXXXXXXXXXXXXX AGGYTGTACXXXXXXXXXXXXXXX TE AE Tag

AGGYTGTACXXXXXXXXXXXXXXX TCCRACATGXXXXXXXXXXXXXXXXX TE AE Tag TCCRACATGXXXXXXXXXXXXXXXXX AGGYTGTACXXXXXXXXXXXXXXX TE AE Tag Ligar e amplificar com os iniciadores A e B AGGYTGTACXXXXXXXXXXXXXXX TCCRACATGXXXXXXXXXXXXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXXCATGTYGGA XXXXXXXXXXXXXXXXXGTACARCCT Ditag Clivar com a enzima de ancoragem Isolar os “ditags” Concatenar e clonar ----CATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCATGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCATG---- ----GTACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTACXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGTAC---- AE Tag1 Tag2 Ditag

TÉCNICA 1-RNA extraído por método TRIZOL (usado no artigo, há outras formas extrair RNA) 2-Síntese de cDNA a partir do RNA. O primer usado é chamado Biotinylated oligo-dT. Ele liga a cadeia poli-A(rica em Adeninas) do RNA devida a sua seqüência rica em Timinas e ele é adaptado a se ligar a esferas magnéticas, o RNAm é isolado devido a essas esferas com aproximação dos tubos a uma bandeja magnética. 3-Enzima de restrição conhecida como enzima de ancoragem cliva na seqüência de 4 pb CATG 5

4- Ligação dos chamados adaptadores (linkers) no local clivado pela enzima de ancoragem ( são A e B na gravura). Os linkers são necessários por que contêm sítios para a próxima enzima de restrição e para os primers que serão utilizados nos próximo passo. PS: No desenho de cima está ruim e errado: CATG faz parte dos linkers, mas está com cor errada. Comparem os círculos nas figuras! Teria q estar como no desenho de baixo!!! 5- Tagging enzyme (TE) cliva cDNA liberando tags. Tag é uma pequena seqüência que é exclusiva de um determinado transcrito. No artigo os tags tinham 21 pb, mas podem ser menores depende do q se está pesquisando. Para visualizar um tag olhe ultimo slide. 6

6- 2 tags se juntam formando um ditag. 7- Primers são usados para amplificar os ditags por PCR. 8- Ditags são isolados através do uso de enzima de ancoragem. 9- Ligação de todos os ditags formando o que se chama de concatâmero. 7

10- Os concatâmeros são clonados em algum vetor como bactérias e depois são sequenciados por máquina, no artigo foi usado: ABI 3730xl capillary sequencer. 8

Experimento de SAGE Contagem das Tags Anotação das Tags Análise dos dados

A Bioinformática têm papel essencial para o SAGE em três funções básicas: Extração e gerenciamento dos dados Anotação das tags Análise estatística (distribuição e comparações)

Extração das Tags Dados estão no formato de cromatogramas Software de Base Calling (Ex.: Phred) para gerar a sequência do concatâmero no formato texto com seu valor de qualidade Extração e contagem das tags

Contagem das Tags Localizar CATG Extração dos Ditags (20 – 34 pb) Descartar ditags duplicadas Obter as 10-17 bases extremas, sendo o complemento reverso a sequencia da direita Descartar adaptadores (linkers) de sequências Contagem das tags

Exemplo >SAGE-WT1-A0001-A01.abd 1047 0 1047 ABI GGCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAATGCATGTTGACGTGCACTTCCGTAGCCTCATGTTTTATGGAATCACCTATTATGCCATGACTTTTTCAAAACTAGGCTGTGCCATGTTTACACAGTATGCACACATCTTCCATGGATGTGGACAGAAAATCCTCCAACATGATGGCAA A tag em azul deverá ser a o complemento reverso da sequência.

Contagem das Tags Softwares que fazem a extração e contagem das tag: SAGE 300 – Zhang et al. (1997) SAGE 2000 – Invitrogen, Inc. (I-SAGE) eSAGE – Margulies & Innis (2000) USAGE (On-line) – van Kampen el at. (2000) SAGEnhaft (On-line) – Beissbarth et al. (2004)

Anotação de SAGE Tags Tag, etiqueta, marcador, assinatura... É uma sequência de 10-17 nt. Uma Tag possui informação suficiente para a identificação de um transcrito único. Mais de 1 gene pode estar relacionado a mesma tag. 1 gene pode estar relacionado a 1 ou mais tags diferentes.

Principais Problemas Erros de amostragem; Erros de sequenciamento; Possibilidade de tags não unívocas; Transcritos que não geram tags utilizando uma dada enzima; Sequências repetitivas;

Como Resolver? Aumento do número de tags coletadas. Uso de tags mais longas. Uso de diferentes enzimas de restrição.

Biblioteca de SAGE Short SAGE: Tag Freq. GCAGACCATA 1451 AACAGTTCCA 931 GCCAACTCGG 2 CGTGCGGATT 1

Biblioteca de SAGE Gerar a lista das CSTs (Confident SAGE Tag): Remover tags com frequência igual a 1; Remover linkers de sequências

Anotação de SAGE Tags Extração das Tags virtuais: Tag Virtual: é uma “tag” extraída computacionalmente. Encontrada nos 10 nt posterior ao sítio da enzima NlaIII na região 3' UTR em mRNA. Cauda de poli-A: quantidade de “A” nas ultimas bases. Sinal de poli-A: AATAAA e ATAAAA nas últimas 50 bases.

SAGE Tags x Tag Virtual Relacionar Tag ao Gene Pode-se encontrar mais de uma tag relacionada a um mesmo gene. Qual a melhor Tag para o Gene? Ranking Tag com alta expressão (Maior pontuação). Tag virtual interna (Menor pontuação).

Extração das Tags Virtuais Onde encontrar os transcritos? Banco de dados públicos: UniGene, RefSeq. Caso não tenha, pode-se usar organismo filogeneticamente próximos para obter uma anotação prévia.