EFEITO DE VÁRIOS COMPOSTOS NA ACTIVIDADE IN VITRO DA FOSFÁTASE ALCALINA DA SALIVA HUMANA NASCIMENTO, João ; OLIVEIRA, José ; SILVA, João Orientador: LEMOS, Clara Dra Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Objectivos Resultados Conclusões Dosear a actividade enzimática da fosfátase alcalina (FA) da saliva humana; Verificar o efeito in vitro de levamisole, sumo de maçã, chá preto, chá preto com glicose e solução aquosa de glicose na actividade enzimática da FA salivar humana; Verificar a influência do grupo sanguíneo do sistema ABO, sexo e uso de contraceptivos orais na actividade da fosfátase alcalina salivar. Análise Geral de Resultados (gráfico 1) Foi confirmado o efeito inibidor do levamisole já descrito, assim como se verificou que a solução de glicose actuou como activador da fosfátase alcalina salivar. Verificou-se uma tendência activadora do chá. Na amostra estudada, o chá com glicose e o sumo apresentaram um efeito activador; no entanto, os resultados obtidos não são estatisticamente significativos. Grupos sanguíneos – sistema ABO (gráfico 2 e 3) Os elementos dos grupos sanguíneos AB e B não foram considerados na análise uma vez que não existiam elementos suficientes (n=0 e n=3 respectivamente). Verificou-se uma forte tendência para uma maior actividade basal da enzima nos indivíduos de grupo sanguíneo O em relação aos de grupo A confirmando-se os estudos anteriores [1]. O efeito do chá com glicose foi superior no grupo sanguíneo O (com significado estatístico), verificando-se ainda uma forte tendência no efeito do chá, da solução aquosa de glicose e do sumo. Sexo (gráfico 4 e 5) Verificou-se uma forte tendência para uma maior actividade basal da enzima nos indivíduos de sexo feminino em relação aos de sexo masculino contrariando as conclusões de estudos anteriores nos quaisquer não se verificavam diferenças [5]. O efeito de todos os compostos testados foi superior no sexo masculino. No entanto, esta diferença apenas é significativa para o sumo e para o chá, verificando-se contudo uma nítida tendência para tal no chá mais glicose e solução aquosa de glicose. Uso de contraceptivos orais (gráfico 6 e 7) Verificou-se uma forte tendência para uma maior actividade basal da enzima nos indivíduos de sexo feminino que afirmaram tomar contraceptivos orais (n=10) ao contrário do que sugeriam estudos anteriores. [3] Verificou-se com significado estatístico que para o chá com glicose os indivíduos que afirmaram tomar contraceptivos apresentaram um efeito superior. Há ainda uma forte tendência para tal diferença em relação ao chá e solução aquosa de glicose. É ainda de referir que no sumo há uma nítida tendência para um maior efeito no grupo que afirmou não tomar quaisquer contraceptivos orais. Comentário geral aos resultados A falta de significado estatísticos de algumas das análises efectuadas prende-se com a disparidade de valores encontrados quer por diferenças fisiológicas entre os indivíduos, quer por possíveis erros decorridos do próprio processo de investigação/experimentação. É ainda de referir que, além dos factores acima descritos, a falta de dados em relação a muitos dos indivíduos dos quais foi recolhida saliva (sexo, grupo sanguíneo, uso de contraceptivos) dificultou o tratamento dos dados e a inferência de resultados objectivos. Introdução A fosfátase alcalina (FA) é uma ecto-enzima (EC 3.1.31.1) que efectua a hidrólise de mono-ésteres fosfóricos com actuação óptima em pH alcalino. [2,4] Esta existe sob a forma de 4 isoenzimas (intestinal, placentária, específica das células germinativas e não específica) e 3 isoformas (renal, óssea e hepática) encontrando-se a sua presença nos fluídos orgânicos intimamente relacionada com os estados fisiológicos e patológicos dos respectivos tecidos. [5] A existência FA em grandes quantidades nas membranas de células envolvidas em transportes transmembranares, sugere uma possível relação desta com o transporte de substâncias. [2] É já conhecido o papel inibidor do levamisole na actividade da isoenzima não específica. [5] Pretende-se avaliar a actividade enzimática da FA presente na saliva humana pelo seu papel de catalizador na desfosforilação do p- nitrofenilfosfato (p-NPP) em p-nitrofenol (p-NP): p-NPP → p-NP + Pi Realizaram-se curvas de calibração e de cinética desta enzima e procedeu-se à determinação da actividade da FA da saliva humana in vitro, sob a presença de levamisole, sumo de maçã, chá preto, chá preto com glicose e solução aquosa de glicose. Gráfico 1 – Resultados Gerais Na amostra, levamisole inibiu, sumo de maçã, chá preto, chá preto com glicose e solução aquosa de glicose estimularam (nmol p-NP.mL saliva-1.min-1) Efeito (% do controlo) Material e Métodos Gráfico 2 – Actividade basal por grupo sanguíneo Na amostra, os indivíduos de grupo O (n=19) apresentaram uma actividade basal superior aos indivíduos de grupo A (n=19) Gráfico 3 – Efeito por grupo sanguíneo Na amostra, o efeito dos compostos testados foi na generalidade superior nos indivíduos de grupo sanguíneo O em relação aos indivíduos de grupo A Durante todo o trabalho experimental foi utilizada uma solução A (47 mg p- NPP/25 mL Tris) contendo substrato para a FA assim como uma solução de NaHO 0,02M, a 4ºC. Incubação: A incubação foi efectuada a 37ºC durante 30min. seguindo-se a adição de 2mL da solução de NaHO a todos os tubos preparados sendo estes mantidos a 4ºC durante 10 min. Todas as absorvâncias foram medidas utilizando um comprimento de onda de 410nm. 1ª Parte Foi construída uma curva de calibração a partir da qual se desenhou um gráfico da cinética enzimática da fosfátase alcalina salivar 2ª Parte Foi analisado o efeito de vários compostos na actividade da enzima em estudo com a preparação dos tubos: C: controlo C+LEV: levamisole (2,408 mg/mL) C+CHA: chá preto (250 mL de água para beber fervida; infusão durante 3 minutos) C+CHA+GLI: chá preto com glicose (6 g glicose adicionados a 100 mL do chá já preparado) C+GLI: solução aquosa de glicose (glicose a 3g/50mL) C+SUMO: sumo de maçã Para o estudo de cada um dos compostos acima, foram utilizados, em cada tubo, 200μL de solução A, 150μL de amostra (saliva previamente homogeneizada) assim como 50μL do composto a testar excepto no controlo. Foi ainda adicionada água destilada até perfazer o volume de 500μL. Incubação. Foi efectuada a leitura da absorvância e calculada a actividade de cada um dos tubos utilizando para tal efeito uma curva de calibração de declive 15,130. NOTA: para cada um dos compostos foi preparado 1 branco e 3 ensaios. A solução A apenas foi adicionada aos brancos após todo o processo de incubação. Amostra e tratamento estatístico Foi utilizada uma amostra de 77 alunos das Faculdades de Medicina e Medicina Dentária da Universidade do Porto sendo 41 do sexo feminino e 34 do sexo masculino (total de 75 alunos), tendo 2 alunos não respondido ao questionário entregue. Os dados foram analisados recorrendo a testes estatísticos para um nível de significância de 5%. Efeito (% do controlo) (nmol p-NP.mL saliva-1.min-1) Gráfico 4 – Actividade basal por sexo Na amostra, os indivíduos de sexo feminino (n=41) apresentaram uma actividade basal superior aos indivíduos de sexo masculino (n=34) Gráfico 5 – Efeito por sexo Na amostra, o efeito dos compostos testados foi na generalidade superior nos indivíduos de sexo masculino em relação aos indivíduos de sexo feminino (NOTA: é de notar que o cha, chagli e sumo tiveram um efeito estimulador no sexo masculino e inibidor no sexo feminino) Bibliografia BAYER PM, Hotschek H, Knoth E (1980). Intestinal alkaline phosphatase and the ABO blood group system--a new aspect. Clin Chim Acta: 108(1):81-7. CALHAU C (2002). Tese de Doutoramento: “Transporte transmembranar e fosfátase alcalina”. HERBETH B, Bagrel A, Dalo B, Siest G, Leclerc J, Rauber G (1981). Influence of oral contraceptives of differing dosages on alpha-1-antitrypsin, gamma-glutamyltransferase and alkaline phosphatase. Clin Chim Acta: 112(3):293-9. MARTINS MJ (2002). Tese de Doutoramento: “Fosfátase alcalina. Actividades em diversas situações fisiológicas e patológicas. Relação com sistemas de transporte transmembranar”. Protocolo Experimental “Fosfátase Alcalina: Projecto de Investigação. Efeito in vitro de várias bebidas na actividade da fosfátase alcalina da saliva.”. Bioquímica 1º Ano, Ano Lectivo 2003/2004 VAN HOOF VO, Hoylaerts MF, Geryl H, Van Mullem M, Lepoutre LG et al (1990). Age and sex distribution of alkaline phosphatase isoenzymes by agarose electrophoresis. Clin Chem 36: 875-8. (nmol p-NP.mL saliva-1.min-1) Efeito (% do controlo) Gráfico 6 – Actividade basal segundo uso de contraceptivos orais Na amostra, os indivíduos de sexo feminino (n=41) que referiram tomar contraceptivos orais (n=10) apresentaram uma actividade basal superior aos indivíduos que referiram não tomar quaisquer contraceptivos (n=30) Gráfico 7 – Efeitos segundo uso de contraceptivos orais Na amostra, o efeito do levamisole e do sumo foi superior nos indivíduos do sexo feminino que afirmaram não tomar quaisquer contraceptivos orais (n=30). Nos outros compostos verificou-se que o efeito foi superior nos indivíduos do sexo feminino que afirmaram tomar contraceptivos orais (n=10)