Virologia Ano Lectivo 2010/11 Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte I

Testes imunológicos Baseiam-se em reacções antígeno-anticorpo: Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar especificamente a um epítopo de um antígeno. Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo. Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Anticorpo Cadeias de glicoproteícas : Cadeias leves Cadeias pesadas Região constante – local de activação de outros elementos dos S. Imune; Região variável – local de ligação ao antigénio Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Anticorpo Tipos de anticorpos Policlonais Obtidos a partir de diferentes clones de células; Monoclonais Obtidos a partir de um único clone de plasmócitos Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Classes de anticorpos no Homem Imunoglobulinas Características IgG Principal Ig sérica Envolvida na activação do complemento e na opsonisação IgM Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda) Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados IgA Presente no soro, secreções e mucosas Tem funções de opsonização. IgD Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando como receptor de antigénios. Funções pouco definidas. IgE Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos e eosinófilos. Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas. Variam nas cadeias pesadas Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Antígeno Epítopo Região do antígeno que reage com o anticorpo Possibilidade de reacções cruzadas Pequenas alterações na estrutura do antígeno, entre outras factores, podem afetar profundamente a ligação com o anticorpo Fig1: um antigénio pode ter diferentes epitopos Fig: exemmplo moleculas virais que pode ser antigenios Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Aplicabilidade Papel importante: Tipo de amostra varia conforme o que queremos pesquisar Diagnóstico Monitorização Tratamento Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Técnicas de Imunologia Reacções Imunoenzimáticas ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay) ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) Imunofluorescência Imunocromatografia ImunoHisto/Citoquímica Análise Proteínas: Western Blot Estas tecnicas tanto podem ser utilizadas para pesquisa de ac como antigénios virais!! Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Reacções Imunoenzimáticas Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

ELISA Baseia-se numa reação imunoenzimática com detecção final por espectrofotometria Permite determinar a concentração do analito Calcular curva de calibração – interpolar a concentração da molécula a quantificar Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Tipos de ELISA Sandwich Poços revestidos com anticorpo especifico Formação de complexos Ac Secundário (conjugado com a enzima) Adição do substrato Medição por espectrofotometria Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Tipos de ELISA Indireto Poços revestidos com antígeno específico Formação de complexos Ac conjugado com enzima Adição do substrato Medição por espectrofotometria Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Tipos de ELISA Competitivo Ac específicos incubados com a amostra Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag Ac secundário Adição do substrato Medição por espectrofotometria Quanto maior a concentração de analito menor a absorbância Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

ELISA Método automatizado Vantagens Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

ELFA Reação imunoenzimática com detecção final por fluorescência. Permite fazer um análise quantitativa Curva de calibração Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

ELFA Teste, geralmente, automatizado onde é necessário: Um cone sensibilizado com Ag, serve, tanto de fase sólida como sistema de pipetagem Uma barrete que contem os reagentes necessários para a realização da técnica Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunofluorescência Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunoflurescência Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência Fluorocromos mais usados Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) Rodamina Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunoflurescência Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semi- quantitativa Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade. Tipos de Imunoflourecênca Directa Indirecta Anti-complemento Técnicas de visualizaçao microscopica suscptivies a erros de mediçao do operador! Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunofluorescência Indireta Etapas Fixação (quando queremos pesquisar Ac as laminas vêm revestidas com o respectivo Ag); Ac primário Ac Secundário (marcado com um fluorocromo); Reagente de contraste Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunofluorescência anti-complemento Etapas Inactivação do complemento endógeno Formação do complexo antigénio-anticorpo Adição do complemento que se liga ao complexo formado Ac conjugado que se liga ao complemento Detecção por microscopia de fluorescência Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunofluorescência Resultados Permite localizar o analito EX: Membrana celular Pesquisa de proteinas virais, por exemplo Análise com o corante de contraste Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunofluorescência Resultados Pesquisa de anticorpos: resultado positivo (fluorescência verde) Pesquisa de proteinas virais, por exemplo Pesquisa de anticorpos: resultado negativo Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunocromatografia Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunocromatografia Teste qualitativo Detecção antigénios virais ou anticorpos Rápido e simples Fase móvel: amostra diluida Fase sólida: membrana revestida Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunocromatografia Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveis devido às partículas de látex Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

ImunoHisto/Citoquímica Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

ImunoHisto/Citoquímica Imunologia e citologia ou histologia Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais, proteínas) Diferenças de expressão de proteínas Localização celular do antigénio Método qualitativo (maior parte dos casos) Quantificação relativa Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

ImunoHisto/Citoquímica Método directo Ac primário marcado enzimaticamente reage directamente com o antigénio Método Indirecto Ac primário que se liga ao antigénio Ac secundário marcado enzimaticamente Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO) Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

ImunoHisto/Citoquímica Principio do método Reacção ocorre em lamina Dadores de electroes mais usados: AEC DAB- 3,3 diaminobenzina tetrahidrocloridrico PO+ H2O2+ Dador de electrões  PO+ H2O2+ precipitado Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

ImunoHisto/Citoquímica Passos importantes Fixação (sol. Alcoólica) Permeabilizar (detergente) Ac primário Ac secundário conjugado Substrato com agente cromogénio Corante de contraste Detergente- Ttriton Fixador- acetona, formaldeido Lavagens Ex de corante de contraste: hematoxicilina de Mayer Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunohistoquímica Imunohistoquímica Detergente- Ttriton Fixador- acetona, formaldeido Lavagens Ex de corante de contraste: hematoxicilina de Mayer Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Imunocitoquímica Imunocitoquímica Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Análise Proteínas Separar proteínas de acordo com o seu tamanha SDS- detergente que dá carga negativa e forma primária as proteinas Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Western Blot SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Separar proteínas de acordo com o seu tamanha SDS- detergente que dá carga negativa e forma primária as proteinas Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Western Blot Blotting Passagem para um membrana de nitrocelulose Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Western Blot Detecção Bloqueio da membrana Ac primário Ac secundário conjugado Detecção Passagem para um membrana de nitrocelulose Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

Western Blot Aplicação Passagem para um membrana de nitrocelulose Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I

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