Introdução a Enzimologia e Processos fermentativos Msc J.Gabriel Roderjan Aula 1 e 2 – Farmácia 8ºP 2009

Plano de Trabalho PROGRAMA TEÓRICO: Plano de trabalho Apresentação da bibliografia; sorteio dos seminários Introdução e Histórico; catálise; atividade enzimática; cinética enzimática; Aplicação clínica das enzimas; Microrganismos e Enzimas de importância aos processos fermentativos Obtenção de enzimas e produtos de digestão enzimática Introdução aos processos fermentativos Seminários: Fermentação alcoólica: Aguardentes e outras bebidas Seminários: Fermentação acética: vinagres Seminários: Fermentação alcoólica: cervejas e vinhos Seminários: Fermentação láctica: vegetais Seminários: Fermentação láctica: leite e derivados Seminários: Fermentação láctica: pescados e ensilados Seminários: Processos biotecnológicos

Apresentação dos tópicos Leitura de bibliografia Discussão dos tópicos Aula teórica Apresentação dos tópicos Leitura de bibliografia Discussão dos tópicos Perguntas

Plano de Trabalho PROGRAMA PRÁTICO: Plano de trabalho de aulas práticas; Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos Obtenção, caracterização e quantificação de enzimas; Biorreatores e transferência de oxigenio em biorreatores Imobilização de enzimas Purificação de enzimas Preparação para fermentação láctica do leite Fermentação láctica: leite Preparação para produção de cerveja Fermentação alcoólica: cervejas

Preparação de processos fermentativos Produção de microrganismos Tutorial Formulação de protocolos de procedimento; Formulação do plano de ação; Check-list; Documentação e legislação Procedimento operacional padrão Resultados e modificações

AVALIAÇÕES AULAS PRÁTICAS Avaliação de desempenho nas aulas práticas   AULAS PRÁTICAS Avaliação de desempenho nas aulas práticas Trabalhos em sala de aula Valor 2,0 PROVAS 1ª prova 1° bimestre - 09/09/2009 - valor 8,0 2ª prova 1°bimestre - 07/10/2009 - valor 8,0 3ª prova 2°bimestre - 04/11/2009 - valor 5,0 4ª avaliação - relatório aulas práticas 2°bimestre - 02/12/2009 - valor 10,0 Provas de 10 à 15 questões, com 1 à 3 questões discursivas SEMINÁRIOS Trabalho impresso Apresentação Valor 5,0

Bibliografia LEHNINGER, Albert L.; NELSON, David L.; COX, Michael M. Lehninger princípios de bioquímica. 4. ed. São Paulo: Sarvier, 2006. xxviii, 1202 p. ISBN 85-7378-166-1 (enc.) ALBERTS, Bruce. Fundamentos da biologia celular. Porto Alegre: ArTmed, 2006. 1 v. (várias paginações) ISBN 78-85-363-0679-7 BRUCHMANN, Ernest-Erich. Bioquímica técnica: Ernst-Erich Bruchmann ; traducido por Aurora Perez Torrome. Zaragosa: Acribia, 1980. 233 p. ISBN 84-200-0437-5 LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio; BORZANI, Walter. Tecnologia das fermentações. São Paulo: E. Blücher, c1975. 285 p. AQUARONE, Eugênio; LIMA, Urgel de Almeida; BORZANI, Walter. Alimentos e bebidas produzidos por fermentação. São Paulo: E. Blücher, 1983. 227 p. (Biotecnologia ; v. 5) CARVALHO, Geraldo Camargo de. Aulas de quimica. São Paulo: Nobel, 1979.v.1 CRUEGER, Wulf; CRUEGER, Anneliese. Biotecnología: manual de microbiología industrial. Zaragosa: Acribia, 1993. 413 p. ISBN 84-200-0743-9 BORZANI, Walter; LIMA, Urgel de Almeida; AQUARONE, Eugênio. Engenharia bioquímica. São Paulo: E. Blücher, 1975. 300 p. (Biotecnologia ; v. 3) AMORIM, Henrique Vianna de; LEÃO, Regina Machado. Fermentação alcoólica: ciência e tecnologia. Piracicaba: Fermentec, 2005. xv, 434 p. ISBN 85-99011-01-04 (enc.) WISEMAN, Alan. Manual de biotecnología de los enzimas. Zaragosa: Acribia, 1991. 444 p. ISBN 84-200-0705-6 http://www.bireme.br/php/index.php www.anvisa.gov.br/ www.fda.gov www.biotecnologia.com.br/ www.atcc.org/ www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme

Modelo de relatório de seminário SUMÁRIO Introdução Aplicação Método (como se utiliza e quais vias bioquímicas envolvidas) Organograma (seqüência de eventos) Legislação e Controle de qualidade Referências Anexos

Aspectos gerais

Vida= fn(matéria x energia) Fn é a transformação de partículas, átomos e moléculas; Reações químicas Estabilidade Conversão da matéria em energia e da energia em matéria Fonte principal: Sol Meio: água

Reações químicas DG = - RT ln Keq A + B ↔ AB AOH + HB ↔ AB +H2O S P Relação entre a constante de equilíbrio e a variação de energia livre de uma reação S P Reação: Keq = [P]/[S] DG = - RT ln Keq Reações com DG’ grande e negativo significa que o equilíbrio é favorável à formação dos produtos

S P Reação = colisão de moléculas em uma determinada orientação com uma quantidade definida de energia denominada ΔG (energia de ativação do estado de transição ou energia livre de ativação)

Facilitadores de reação Catálise = alteração na velocidade da reação William P. Jencks, article in Advances in Enzymology, 1975 Redução na energia de ativação (ΔG); Sem um catalisador : A + B ↔ AB em 20 minutos e X de ΔG Com um catalisador : A + B ↔ AB em 20 milésimos de segundo e X/5 de ΔG

Tabela da relação entre constante de equilíbrio e energia livre de ativação ΔG

A lei de velocidade A velocidade de uma reação e a energia de ativação a) Reação de 1ª ordem: V = k [S] (uni molecular) b) Reação de 2ª ordem: V = k [S1][S2] k  M-1 S-1 (bi molecular) Obs. uma pequena diminuição na energia de ativação, corresponde a um grande aumento na velocidade da reação

Vantagem da catálise Reação com vários passos: velocidade é determinada pelo passo com a mais alta ∆G++ Energia de ativação: barreira energética para as reações químicas. Seletividade celular: reações necessárias para sobrevivência da célula: ∆G++ menores;

Quem faz a catálise? Catalisador = qualquer molécula que facilite a reação. Participa da reação, mas ao final é recuperado de forma a não ser alterado nem consumido na reação. Os reagentes e o catalisador encontram-se na mesma fase, geralmente é líquida; A reação evolui através de espécies intermédios com menor energia de ativação; A reação tem mais do que um passo. E + S ES EP E + P

Tipo de catálise

Biomoléculas e a catálise Carboidratos Lipídeos Proteínas

Proteínas funcionais Seqüência amino acídica é quase infinita Combinação de 20 aminoácidos sem limite de número e repetições Formação estrutural multivariável Adaptação a vários estados e ambientes

Enzimas = Proteínas funcionais Proteínas altamente especializadas com extraordinário poder catalítico.

O Estado de Transição de produto e substrato na ausência de um catalisador ou enzima. As enzimas reduzem a energia de ativação sem alterar a constante de equilíbrio acelerando o processo da reação.

O que há de especializado na função da enzima? Alto grau de especificidade pelo substrato; Aceleram as reações; Atividade depende da temperatura, pH, substrato, co-fatores e produto; São as principais responsáveis para cada processo bioquímico: catabolismo e Anabolismo

O que confere a enzima catalisar reações bioquímicas? Estrutura especializada voltada ao substrato A forma complementar, carga e características hidrofílicas/hidrofóbicas, são responsáveis por esta especificidade.

Catálise enzimática

O Ajuste Induzido Mudança conformacional na hexoquinase induzida pela ligação da glicose em seu sítio ativo, faz com que a enzima seja ativada.

A Enzima é Complementar a seu Substrato no Estado de Transição

História da Enzimologia Pasteur declarou que "a fermentação alcoólica é um ato correlacionado com a vida e organização das células do fermento (levedura), e não com a sua morte ou putrefação". Enzima – do grego ενζυμον, “levedar” ou fermentar – Kuhne 1878; Buchner provou que extratos de levedura tinham a capacidade de fermentar - 1897

Histórico Sumner provou que as enzimas eram proteínas através da cristalização da urease – 1926; John Northrop e Wendell Meredith Stanley confirmaram as enzimas como proteínas pelo estudo da tripsina, quimotripsina e pepsina – 1930. Próximo passo é o estudo da catálise enzimática ao nível quântico.

Especificidade Eficiência Ação da enzima no substrato é dependente de: Presença de substrato em concentração adequada; pH Temperatura Concentração de produto; Cofatores Meio (sólido ou líquido)

COFATORES necessários para o funcionamento da enzima Coenzima: quando o cofator não se liga covalentemente à enzima Grupo prostético: quando o cofator se liga covalentemente à enzima Holoenzima: enzima + cofator (enzima cataliticamente ativa) Apoenzima ou apoproteína: refere-se somente a parte protéica da enzima As enzimas reguladas por modificações não-covalentes são chamadas de alostéricas.

Cofatores inorgânicos: íons

A Catálise Enzimática e o Complexo Enzima-Substrato Quimiotripsina O centro ativo: região da enzima onde ocorre a catálise Sítio ativo – porção da estrutura protéica da enzima onde liga-se o substrato

Coenzimas

Nome comum da enzima: Hexoquinase ATP + GLICOSE ADP + GLICOSE-6-FOSFATO Nome comum da enzima: Hexoquinase Nome sistemático: ATP:Glicose fosfotransferase Classificação: E.C.2.7.1.1

ATP:Glicose fosfotransferase E.C.2.7.1.1 [EC number]: número de comissão da enzima 2  transferase 7  sub-classe: fosfotransferase 1  grupo hidroxil (como grupo aceptor) 1  D- glicose que aceita o grupo fosforil. Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular. www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.

Nomenclatura das enzimas ATP:Glicose fosfotransferase E.C.2.7.1.1 [EC number]: número de comissão da enzima 2  transferase 7  sub-classe: fosfotransferase 1  grupo hidroxil (como grupo aceptor) 1  D- glicose que aceita o grupo fosforil. Nomenclatura da união internacional Bioquímica e Biologia Molecular. www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme.

Cinética enzimática

Efeito da Concentração do Substrato na Velocidade Inicial de uma Reação Enzimática [E] = constante e limitante Equação de Michaelis-Menten

Quando [S] tende a zero (reação de 1ª ordem) Quando [S] tende para infinito (reação de ordem zero) Constante de Michaelis-Menten (Km) É a concentração do substrato [S], quando Vo = Vmax/2

A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN k1 k2 Modelo Cinético: E + S ES E + P k-1 K-2 Aproximações: Admitindo-se a reação em seu início: k1 k2 E + S ES E + P k-1 2. Considerando-se a segunda etapa como passo limitante, tem-se que a velocidade inicial da reação (Vo) é dada por: Vo = k2 [ES] (eq. 1)

Vf = k1 [EL][S] ou Vf = k1 ([ET] – [ES]) [S] (eq. 2) A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN 3. Considera-se que a concentração de S é muito maior que a de enzima e despreza-se a quantidade de substrato complexada com a enzima, em relação à concentração total de substrato Note que, numa reação enzimática, a enzima se encontra na forma livre (EL) e na forma complexada com o substrato (ES), daí: [EL] = [ET] - [ES] 4. Considerando-se estado estacionário, a concentração de ES permanece constante, ou seja, a velocidade de sua formação (Vf) é igual à de seu desaparecimento (Vd) Vf = k1 [EL][S] ou Vf = k1 ([ET] – [ES]) [S] (eq. 2) Vd = k2 [ES] + k-1 [ES] ( eq. 3)

A EQUAÇÃO DE MICHAELIS-MENTEN Igualando a eq. 2 com a eq. 3 e rearranjo os termos, temos: [ET] [S] [ES] = (eq. 4) [S] + Km onde, Km = (k-1+k2)/k1 (Constante de Michaelis-Menten) Combinando a eq. 1 com a eq. 4, temos: k2[ET] [S] Vmax [S] Vo = ou Vo = [S] + Km [S] + Km

Modo mais correto de se determinar Vmax e Km O gráfico de 1/vo x 1/[S] A forma dos inversos da equação de Michaelis-Menten ou equação de Lineweaver-Burk Modo mais correto de se determinar Vmax e Km

O significado de Km e a afinidade enzimática Se k2 << k-1, tem-se que Km = k-1/k1 e, portanto a constante de dissociação do complexo ES

Reações que ocorrem em várias etapas em que o passo EP E + P é o limitante Passo limitante kcat = k3 e [EP] ~[Et] kcat é denominado de número de renovação: equivale ao n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única enzima em uma dada unidade de tempo, quando a enzima está saturada com o substrato

A Relação kcat/Km Para [S] << Km Vo depende da concentração de dois reagentes e o termo kcat/Km é um constante de 2ª ordem. É considerado o melhor parâmetro cinético para comparar eficiência catalítica

Reações com Dois ou Mais Substratos (Mecanismo de dupla troca ou pingue-pongue)

Cinética envolvendo um complexo ternário Cinética de dupla troca ou pingue-pongue

Inibição Reversível a) Inibição Competitiva KI é a constante de dissociação do complexo EI

Cinética de uma Inibição Competitiva EI E + I KI é a constante de dissociação do complexo EI

Inibidor Competitivo Não altera a velocidade máxima da reação, porém aumenta a constante de Michaelis-Menten ou seja: V’max = Vmax K’m > Km Admitindo-se que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor diminui a afinidade da enzima pelo substrato Inibição competitiva pode ser revertida por aumentos na concentração do substrato

b) Inibição não-competitiva K’I é a constante de dissociação do complexo ESI

Cinética de uma Inibição não -competitiva ESI ES + I K’I é a constante de dissociação do complexo ESI

Inibidor não-competitivo Diminui a velocidade máxima da reação e a constante de Michaelis-Menten ambos por um mesmo valor (a’): V’max < Vmax K’m < Km Note que independentemente do valor de a’ o coeficiente angular da reta 1/Vo x 1/[S] será sempre o mesmo, daí as retas serem paralelas

c) Inibição Mista Quando KI = K’I, temos a inibição não competitiva K’I é a constante de dissociação do complexo ESI Quando KI = K’I, temos a inibição não competitiva

Inibição Mista 1/vo [I] Sem inibidor 1/[S] - 1/Km Inibição não competitiva a = a’ 1/vo [I] - 1/Km Sem inibidor 1/[S] (Vmax/a) [S[ Vo = Km + [S]

Inibição Não Competitiva MISTA Não altera a constante de Michaelis-Menten, porém diminui a velocidade máxima da reação V’max < Vmax K’m = Km Admitindo que o inverso de Km represente a afinidade enzimática, pode afirmar que este inibidor não afeta a afinidade da enzima pelo substrato Numa inibição mista Vmax diminui e Km aumenta

Inibição Irreversível Inibidores irreversíveis são importantes ferramentas no estudo do mecanismo de uma reação enzimática Inibição da quimotripsina com o diisopropilfluorofosfato (DIFP), leva à conclusão que a Ser195 é um resíduo chave na catálise Inibidores Suicidas: classe de inibidores irreversíveis pouco reativos, mas que no centro ativo da enzima são modificados e reagem irreversivelmente com a enzima inativando-a. São substâncias utilizadas na industria farmacêutica como remédios ou drogas de poucos efeitos colaterais

Efeito do pH na Atividade Enzimática Os grupos laterais dos aminoácidos podem se encontrar com carga positiva, negativa ou neutra, dependendo do pH

Efeito da Temperatura na Atividade Enzimática Vo 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (°C) A atividade aumenta com a temperatura até o ponto onde a enzima não se desnatura

Efeito da Concentração de Enzima na Atividade Enzimática Vo (mmol/s) [S] em excesso Concentração de Enzima (mM) Se o substrato não estiver em excesso, a velocidade da reação atinge um valor máximo e permanece constante

As Enzimas Reguladoras Enzimas que têm sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais 1º Tipo: Enzimas Alostéricas: são reguladas por ligações não covalentes

A Aspartato Transcarbamilase R (2 cadeias)

Inibição por Retroalimentação ou Feedback da Conversão de L-Treonina em L-Isoleucina E1 é a enzima desidratase da L-treonina, que é inibida de forma alostérica por L-isoleucina

Cinética Sigmoidal das Enzimas Alostéricas Com um modulador positivo e um ne-gativo, sem alterar Vmax O substrato é um modulador positivo Com um modulador negativo que não altera K0,5

Algumas Enzimas Reguladoras Sofrem Modificações Covalentes

Regulação Covalente da Fosforilase do Glicogênio Regulação alostérica por AMP (secundária)

AMP glicose Ser-P Piridoxal-P Piridoxal-P glicose Ser-P AMP

Regulação enzimática por clivagem proteolítica Ativação do zimogênio por clivagem proteolítica

Estrutura da quimiotripsina