Fungos Mofos/bolores: deterioração alimentos e outros materiais Fungos do ambiente natural: importância na degradação matéria orgânica (saprófitas) Fungos patogênicos: infecções superficiais (pele e mucosas) e sistêmicas Fermentação: produção alimentos e medicamentos (hormônios/antibióticos)

Fungos Até 1969, os fungos eram considerados vegetais. Atualmente constituem o reino Fungi, pois apresentam um conjunto de características próprias que permitem sua diferenciação das plantas: não sintetizam clorofila, não tem celulose na parede celular. São eucariotos e heterotróficos, obtendo nutrientes e energia a partir da matéria orgânica: inanimada (saprófitas) proveniente de seres vivos (parasitas). Podem ser pluricelulares ou unicelulares dependendo da espécie e/ou condições de crescimento. As espécies saprófitas decompõem resíduos de animais e plantas, liberando compostos que auxiliam a fertilidade do solo.

Fungos Reprodução: sexuada e/ou assexuada, dependendo da espécie. Habitat: Os fungos têm grande poder de adaptação às variações ambientais, são capazes de crescer em grandes concentrações de açúcar, em pHs de 2,0 a 9,0 e ampla faixa de temperatura (0ºC a 60ºC). Disseminados em ambientes naturais

Fungos Os fungos dividem-se em 2 grandes grupos: 1-Fungos filamentosos: também conhecidos como bolores, formam HIFAS (conjunto de células), que agrupadas formam o corpo vegetativo ou MICÉLIO e a porção reprodutiva (corpo de frutificação), onde se formam os ESPOROS.

Fungos Parede celular constituída de hexoses e hexoaminas, que formam mananas, ducanas e galactanas (açúcares). Alguns fungos têm parede rica em quitina (N-acetil glicosamina), outros possuem complexos polissacarídios e proteínas, com predominância de cisteína.

Fungos Cultivo: semelhante ao das bactérias heterotróficas (pH mais ácido p/ tornar meio seletivo). Crescimento mais lento, principalmente dos fungos filamentosos (pluricelulares), que podem levar 5 a 7 dias para crescer no meio de cultura

Fungos Leveduras: são fungos não filamentosos, que permanecem na forma unicelular. Crescem mais rapidamente do que os fungos filamentosos Tem parede celular rígida e na coloração de Gram são vistos como G+ (não são classificados pelo Gram) São amplamente distribuídos na natureza (grande número de espécies saprófitas e algumas parasitas- patogênicas). Reprodução assexuada por gemulação (maioria) ou por fissão binária (semelhante às bactérias).

Leveduras

Fungos Patogênicos Podem ser Filamentosos e/ou leveduriformes Alguns fungos patogênicos são dimórficos, ou seja, crescem no ambiente na forma filamentosa (vida livre) e quando esporos deste tipo de fungo conseguem penetrar no organismo hospedeiro crescem na forma de levedura Forma filamentosa- temperatura ambiente Forma levedura – temperatura do hospedeiro 37ºC Ex: Criptococcus neoformans Paracoccidioides brasiliensis

Tipos de infecções Fúngicas Micoses superficiais: resposta inflamatória mínima, fácil tratamento, consequências apenas estéticas. Ex. tinea vesicolor (manchas brancas na pele) Micoses cutâneas: fungos dermatófitos Tratamento + difícil Podem ser agudas ou crônicas Micoses subcutâneas: derme e tecido subcutâneo Provocadas por espécies ambientais que penetram via trauma. Semelhantes à infecções bacterianas Tratamento difícil, excisão cirúrgica do foco infeccioso.

Tipos de infecções Fúngicas Micoses sistêmicas: a) patógenos primários, hospedeiro sadio, aspecto infecção crônica , geralmente pulmonar (semelhante tuberculose), ex Histoplasma capsulatum, cresce em fezes de morcego e aves, contaminação via inalação de esporos b) Fungos oportunistas, presentes no ambiente e/ou no organismo e provoca infecção no hospedeiro debilitado Ex: C. albicans Os principais fungos envolvidos em infecções em humanos são de vida livre e a aquisição geralmente por contatos acidentais como inalação de esporos e traumas na pele.

Infecções fúngicas Normalmente leves e autolimitadas mas dependem da imunidade inata elevada Fatores de resistência do hospedeiro: Ressecamento e renovação epitélio pH relativamente baixo Presença de ácidos graxos Flora bacteriana competidora Alterações na flora normal (ex: uso de antibióticos), permitem proliferação de fungos oportunistas. Traumas na pele e mucosas facilitam penetração Como toda infecção, a evolução é determinada pela virulência do agente, tamanho do inóculo e defesas hospedeiro

Infecções Fúngicas Nos tecidos do hospedeiro, os fungos são detidos por mecanismos inespecíficos (ex: proteínas presentes no soro humano fixadoras de ferro, reduzem disponibilidade deste nutriente p/ microrganismo) Reação inflamatória inespecífica importante p/ eliminação agente. Algumas espécies podem proliferar no interior de macrófagos (ex. H. capsulatum). Indivíduos susceptíveis: portadores de AIDS, neoplasias, transplantados, grandes queimados, receptores de terapia bacteriana de amplo espectro, alterações imunológicas que facilitam infecção: redução nº de neutrófilos ativos. Agentes: C. albicans (rins, pulmões, SNC) Aspergillus fumigatus (pulmões) em imunossuprimidos

Micoses sistêmicas primárias Histoplasmose/H. capsulatum/dimórfico/ pulmonar Blastomicose/ Blastomyces dermatitidis/ dimorfico/pulmonar,osseo e cutâneo simultane/te Coccidioidomicose/Coccidioides immintis/ dimórfico/ 60% assintomáticos e autorresolutivas/40% graves – meningites Paracocidioidomicose/ Paracoccidioides brasiliensis/ dimorfico/pulmonar/predominante sexo masculino e ocupacional. Restrita a América central e do Sul

Micoses subcutâneas Climas tropicais Risco ocupacional (contato com solo e vegetais em decomposição), penetração do fungo através de trauma pele Tratamento cirúrgico

Micoses Cutâneas Mais frequente em crianças, desaparecem espontaneamente na puberdade. Dermatófitos, presentes no solo, pelo/pele de animais e humanos. Tineas – cabeça/cabelo pé – (pé de atleta) virilha unhas

Diagnóstico infecções fúngicas Microscopia: biópsia do tecido lesado ou microscopia do fungo – microcultivo p/ fungos filamentosos, para identificação por aspectos morfológicos. Cultura: usada + frequentemente no caso de oportunistas (ex: Candidas), nem sempre útil, dependo do local infectado. Ex, isolar leveduras em hemocultura indica infecção grave, isolar em secreção vaginal, só tem significado se corresponder a sintomas típicos (fazem parte da flora vaginal) Boa para patógenos primários como H. capsulatum Crescimento lento – diagnóstico demorado Sorologia: p/ micoses profundas

Fungos – identificação espécies clínicas Fungos filamentosos: Baseada na morfologia do micélio vegetativo e corpo de frutificação (bolores). Além dos aspectos macroscópicos da colônia crescida em placa de cultura contendo meios específicos para fungos, para observação dos aspectos microscópicos é necessário o cultivo em lâmina de microscopia para observação de estruturas – microcultivo a identificação das espécies é mais complicada (micologistas treinados)

Microcultivo Fungos Semear o fungo em um pequeno bloco de ágar colocado sobre lâmina em uma câmara de cultivo (placa de petri forrada com papel úmido e ambiente estéril) Cultivar por 7 dias, corar e montar lâmina p/ observação. Permite observar estruturas intactas.

Análise morfológica Cultivo em lâmina Fonte: Manual da Anvisa, 2005- Módulo 7

Fungos – identificação espécies clínicas Leveduras - CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA É baseada no metabolismo de açúcares (denominada zimologia ou zimograma) e aspectos morfológicos das células (microcultivo, à fresco e coradas) As amostras clínicas dos s fungos Dimóficos, (espécies que dependendo da temperatura apresentam-se na forma de levedura ou na forma filamentosa), são cultivados a 37ºC e identificados como as leveduras 25ºC – estão na forma filamentosa

Diagnóstico Laboratorial Exame direto: levedura ou fungo filamentoso ? Cultura: isolamento e identificação Condições adequadas de incubação Meio de cultivo Temperatura Tempo

Diagnóstico Laboratorial Meios de cultivo mais utilizados em micologia Agar Sabouraud com cloranfenicol (leveduras e fungos filamentosos) Agar PDA (batata-dextrose) (fungos filamentosos) Agar Mycobiotic=Mycosel= agar seletivo para fungos patogênicos (uso restrito=inibe vários fungos sensíveis à cicloheximida, inclusive leveduras)

Exame direto da amostra “a fresco” entre lâmina e lamínula após clarificação com KOH (10 a 20%)- filamentosos com tinta da China (nanquim) coloração: . esfregaços (Gram, Giemsa e outras) . cortes histológicos (Mucicarmin de Mayer, Gomori-Grocott, H.E.) Aspectos microscópicos Leveduras com filamentação (hifas) abundante: Candida spp. escassa: Candida spp e outros de gêneros (p.ex. hifas curtas,curvas=Malassezia spp) Leveduras sem filamentação e sem cápsula: Candida spp capsuladas: Cryptococcus neoformans

Identificação Laboratorial Exame direto - Leveduras

Coloração de GRAM

Coloração de Gomori-Grocott Fonte: Laboratório de Micologia – IMT – LIM – HC/FMUSP

Identificação Laboratorial Pureza das colônias Detecção por exame direto Sub-cultivo Técnica de esgotamento Meios seletivos Cloranfenicol: inibir bactérias Cicloheximida: inibir fungos anemófilos (alergias)

Alternativa: meios cromogênicos CHROMagar Candida Sugere espécie conforme cor da colônia: Verde = C. albicans Azul = C. tropicalis Rosa = C. krusei Branco = outras espécies e outros gêneros

Métodos clássicos de identificação de leveduras Análise morfológica presença de cápsula produção de tubo germinativo, em geral leitura às 2h cultivo em lâmina (micromorfologia, filamentação e presença de clamidosporos- estruturas de resistência)

Tubo germinativo Identificação presuntiva e rápida de Candida albicans Descrito em 1960 Capacidade de formar filamentos na presença de soro (1-3 h) Humano, fetal bovino ou cavalo Técnica simples 94-97% de positividade para C. albicans Sidrim et al., 1999

sair Fonte: Manual da ANVISA, 2005-Módulo 7

1 - ausência de tubo germinativo 2 - presença de tubo germinativo Análise morfológica Produção de tubo germinativo 1 2 1 - ausência de tubo germinativo 2 - presença de tubo germinativo

Produção de tubo germinativo

Cultivo em lâmina sair Espécies de Candida spp

cápsula

Fluxograma para Identificação de Leveduras de Importância Médica Cultura positiva Fluxograma para Identificação de Leveduras de Importância Médica Exame direto Bactéria Levedura Cultura Pura Sim Não Obter Colônia Pura por isolamento Cápsula + - Macromorfologia Tubo Germinativo Colônia bege: Criptococcus sp Colônia salmão/laranja: Rhodothorula sp - + C. albicans Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina

Tratamento Nem sempre necessário: Micoses superficiais são autolimitadas Agentes antifúgicos: geralmente tóxicos, pois não são totalmente seletivos (fungos são eucariotos) e tem valor terapêutico limitado Os melhores antifungicos são os que afetam a membrana celular do fungo (diferente da célula humana) e/ou interferem com metabolismo celular do fungo.