Controle Microbiológico de Produtos não estéreis PESQUISA DE PATÓGENOS

Pesquisa de Patógenos Microrganismos a serem pesquisados devido à sua presença indesejável nas formulações farmacêuticas, segundo Resolução 481/99: - Staphylococcus aureus - nas preparações tópicas em Geral. - Pseudomonas aeruginosa - preparações tópicas, principalmente para áea dos olhos. - Escherichia coli - nas preparações orais. Salmonella sp - Nas preparações orais. Obs. Pode ser tb interessante a pesquisa de outras cepas ou grupos microorganismos, tais como coliformes.

Staphylococcus aureus – Familia Staphylococcaceae – Coco Gram (+) cacho de uva – Anaeróbios facultativos • Doenças – Infecções cutâneas – Infecções oportunistas – Das vias urinárias – Sistêmicas potencialmente fatais

Pseudomonas aeruginosa – Bacilo Gram (-) – Anaeróbios facultativos • Infecta – Aparelho pulmonar – Aparelho urinário – Queimaduras – Infecções Sanguíneas

Escherichia coli • Escherichia coli – Familia Enterobacteriaceae – Bacilo Gram (-) flagelado – Anaeróbios facultativos – Fermentadores de açúcares - Lactose (+) • Doenças – Gastroenterites

Salmonella sp • Salmonella – Familia Enterobacteriaceae – Bastonetes Gram (-) flagelado – Anaeróbios facultativos – Fermentadores de açúcares • Sintomas da Salmonelose – Febre – Náuseas – Vômito – Diarréia

Procedimentos: Sofrem pequenas distinções entre os vários compêndios oficiais, entretanto os aspectos básicos são mantidos. Segue- se apenas com a citação dos diferentes meios de cultura recomendados.

Sequência para execução das etapas para realizar pesquisa de patógenos em amostras de produtos não estéreis: Amostragem matéria-prima, medicamentos ou cosméticos não estéreis; Determinação tomada de ensaio da amostra a ser analisada; Enriquecimento não seletivo da amostra; Isolamento seletivo utilizando meios cultura seletivos; Realização coloração de gram e provas bioquímicas pertinentes.

Meios de Enriquecimento Tomada de ensaio: 10 g(mL). Enriquecimento não seletivo (100 mL): - Caldo lactose (CL): Escherichia coli e Salmonella sp - Caldo caseína-soja (TSB): Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. Ambos incuba: 35 – 37ºC - 24 a 48 horas Enriquecimento seletivo para Salmonella sp: - 10 mL da suspensão resultante do caldo não seletivo para os caldos tetrationato (100mL) e selenito-cistina (100mL) por 24 horas a 36±1ºC.

Meios de Diferenciação - Após enriquecimento seletivo e não-seletivo (Salmonella sp), alíquotas são transferidas, por repique (estria), para meios de cultura para isolamento e diferenciação visando a identificação do microorganismo.

Staphylococcus aureus • Ágar Baird Parker – colônias pretas, halo transparente.

Staphylococcus aureus Ágar Vogel-Johnson • colônias pretas, halo amarelo Ágar Manitol • colônias amarelas, halo amarelo Meio de cultura sem inoculação Ágar Manitol Ágar Vogel-Johnson

Pseudomonas aeruginosa • Ágar Pseudomonas Base – colônias amareladas a douradas • Ágar Cetrimida – colônias esverdeadas com fluorescência Placa não-inoculada Placa inoculada Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa • Ágar Pseudomonas para Fluoresceína (A e C) – colônias claras e amarelas, com fluorescência amarela. • Ágar Pseudomonas para Piocianina (B e D) – colônias esverdeadas, com fluorescência azul.

Escherichia coli • Ágar Mac Conkey Ágar Eosina-Azul de metileno (EMB) – colônias vermelho-tijolo a púrpura – com halo de precipitação de bile Ágar Eosina-Azul de metileno (EMB) – colônias vermelho-escuras, brilho metálico

Escherichia coli Ágar Endo – colônias rosadas a vermelho, brilho metálico.

• Enriquecimento seletivo – caldo selenito-cistina e tetrationato Salmonella sp • Enriquecimento seletivo – caldo selenito-cistina e tetrationato • Meio de isolamento • Ágar Verde Brilhante – colônias transparentes Ágar sulfito de bismuto – colônias pretas ou esverdeadas

Teste de promoção de crescimento dos meios • Verificar a capacidade de promoção de crescimento do meio de cultura. • São utilizados microrganismos testes: – Para TSB (tryptone soya broth) , TSA (tryptone soya agar) : S.aureus e P. aeruginosa – Para CL (caldo lactose): E.coli e Salmonella – Para Sabouraud: C.albicans

Conforme Portaria 348/97 que determina a todos estabelecimentos produtores de Produtos de Higiene Pessoal, Cosméticos e Perfumes, o cumprimento das Diretrizes estabelecidas no Regulamento Técnico - Manual de Boas Práticas de Fabricação para Produtos de Higiene Pessoal, Cosméticos e Perfumes. TSA (Tryptone Soya Ágar) como meio de crescimento para bactérias, incubação a 35 a 37º C, durante 48h. SDA (Sabouraud Dextrose Ágar) como meio de crescimento para fungos, incubação a 20-25º C, durante 7 dias.

MÉTODO DE ANÁLISE DE PRODUTOS NÃO ESTÉREIS Pote de creme 10g TSB CL SAB TSA CETR MAN. Mac SALM 10-1 Inativante + diluente 90 mL 0,1mL 9 mL 1mL 10-2 10-3 Inativante + diluente 9 mL fungos bactérias Staphylococcus E. coli Salmonella Pseudomonas