Seleção de Transconjugantes

Tópicos a abordar: Resultados da aula anterior Tipos de antibióticos Encontro entre bactérias Bactéria dadora Bactéria recetora Transconjugantes

População da placa de conjugação Meios de cultura -Tipos de meios de cultura -Exemplos de meios de cultura Meio de seleção Previsão das colónias que se esperam obter Colónias âmbar Colónias vermelhas

Antibióticos AMC – Amoxicilina + Ácido Clavulânico FOX – Cefoxitina (cefalosporina da 2ª geração) NA – Ácido Nalidíxico (quinolona da 1ª geração) ATM – Aztreonamo (monobactamo) KF – Cefalotina (cefalosporina da 1ª geração) FEP – Cefepima (cefalosporina da 4ª geração)

Aspeto inicial das placas 999 K802N

Aspeto inicial das placas 405 405

Resultados da aula anterior   405 999 K802N AMC (amoxicilina + clavulânico) 4 mm RESISTENTE SENSÍVEL 0 mm NA (ácido Nalidíxico) 23 mm 24 mm ATM (aztreonamo) 1 mm Sinergismo com AMC FEP (cefepima) 18 mm FOX (cefoxitina) 8 mm 25 mm KF (cefalotina) 10 mm

Resultados da aula anterior   Resistente Intermédio Sensível Classe AMC (amoxicilina + clavulânico) ≤ 13 mm 14 – 16 mm ≥ 17 mm Penicilinas NA (ácido Nalidíxico) 14 – 18 mm ≥ 19 mm Quinolonas ATM (aztreonamo) ≤ 15 mm 16 – 21 mm ≥ 22 mm Monobactamos FEP (cefepima) ≤ 14 mm 15 – 17 mm ≥ 18 mm Cefalosporina B FOX (cefoxitina) KF (cefalotina) ≤ 14 mmm Cefalosporina A

β - Lactâmicos Anel β–Lactâmico Inibem a síntese da parede celular bacteriana, por inibição das transpeptidases

Penicilinas Anel β-Lactâmico associado a um anel de tiazolidina Ativas contra bactérias Gram positivo, não produtoras de β- lactamases e com fraca atividade contra bactérias Gram negativo

Amoxicilina (AMX) β-lactâmico de espectro moderado utilizado no tratamento de infeções bacterianas

Cefalosporinas Anel β-lactâmico associado a uma molécula de dihidrotiazina Atividade contra bactérias Gram negativo Resistentes a β-lactamases estafilocócicas 1ª, 2ª, 3ª,4ª geração

Cefoxitina Cefalosporina 4ª geração Menos ativa que as primeiras contra cocos Gram positivo Moderadamente resistentes às beta-lactamases dos bacilos Gram negativo

Cefepima Largo espectro Estáveis contra beta-lactamases de largo espectro Colmatam deficiências das cefalosporinas da 3ª geração

Cefalotina Cefalosporinas da primeira geração Maior atividade contra bactérias de Gram positivo do que Gram negativo

Monobactamos Inibem a síntese da parede bacteriana Inibidores de bactérias Gram negativo

Aztreonamo β-lactâmico monocíclico Molécula anfotérica Espectro de actividade: Com atividade: bacilos Gram negativo anaeróbios Sem atividade: bactérias Gram positivo, aeróbios restritos

Quinolonas São efetivos contra Gram-negativos e positivos Inibição do DNA girase e de topoisomerase IV Ácido nalidíxico: inibe a síntese dos ácidos nucleicos

Encontro bacteriano: Conjugação MAS COMO SE FAZ? Conjugação é a transferência de DNA plasmídico de uma bactéria dadora para uma bactéria recetora “Mating” designa o contacto físico entre a bactéria dadora e a bactéria recetora MAS COMO SE FAZ?

Procedimento: Técnica Assética Em caldo Misturam-se 100 μl da bactéria dadora e da bactéria recetora num cado fresco. Em agar Numa placa de gelose aplicam-se 100 μl da bactéria recetora sob a forma de gota. Aplicam-se da mesma forma 100 μl da bactéria dadora superiormente à recetora. Técnica Assética

Estirpes bacterianas Dentro das bactérias Gram negativas, as da família Enterobacteriaceae, nomeadamente Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae são as principais responsáveis pelas infeções do trato urinário, devido em parte à sua grande capacidade adaptativa.

Bactéria Recetora Estirpe K802N: E.coli Resistente ao ácido nalidíxico resistência codificada por mutação no DNA cromossómico Bacilo de Gram Negativo GLUC + (via ácido mista) LAC – Citocromo c oxidase – Móvel Produtora de indol Reduz nitratos a nitritos (nitrado redutase +)

Bactéria Dadora Estirpe 999: Klebsiella pneumoniae Resistente à amoxicilina resistência codificada por DNA plasmídico Bacilo de Gram Negativo GLUC + (via butileno-glicólica) LAC + Citocromo c oxidase – Urease + Reduz nitratos a nitritos (nitrato redutase +)

Transconjugantes São as bactérias que queremos obter e isolar!! CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS Possuem resistência ao ácido nalidíxico e à amoxicilina Possuem todo o fenótipo das bactérias recetoras

Que tipo de bactérias se desenvolverão na placa de gelose? Placa de Conjugação Que tipo de bactérias se desenvolverão na placa de gelose? Bactérias Recetoras Bactérias Dadoras Transconjugantes Como passar para o meio de seleção?

Procedimento Técnica Assética Faz-se uma diluição em soro fisiológico Espalha-se na placa de seleção Promove-se o crescimento bacteriano - incubação Técnica Assética

Meios de cultura Contêm todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento dos microorganismos, sob a forma assimilável e em concentração não inibitória

Meios de cultura Devem ser esterilizados e para manter a cultura pura é necessário manipulá-los recorrendo à técnica assética Podem ser classificados de acordo com o seu estado físico, composição química e objetivos funcionais Permitem manter os microorganismos viáveis no laboratório sob a forma de culturas puras

Meios de cultura A sua especificidade é muito importante, pois permite tirar muitas conclusões Permitem o isolamento, identificação e estudos importantes como o da sensibilidade aos antibióticos

Cled Diferencial para a lactose Não selectivo CONSTITUIÇÃO: Extrato de carne Lactose Agar L-cisteína Água Diferencial para a lactose Não selectivo Indicador de pH: Azul de bromotimol   Ácido: Amarelo Básico: Azul esverdeado

Cled

Mannitol Diferencial para o manitol Selectivo para as Gram (+) CONSTITUIÇÃO: Extrato de carne peptona manitol Agar Água Elevada [NaCl] Indicador de pH: Vermelho de fenol   Ácido: amarelo Básico: vermelho/rosa

Mannitol

McConkey Diferencial para a lactose Selectivo para Gram (-) CONSTITUIÇÃO: Peptona Lactose Agar Sais biliares Cristal violeta Água Indicador de pH: Vermelho neutro   Ácido: vermelho Básico: âmbar/incolor

McConkey

Meio de seleção Meio que permite que se detetem as bactérias com as características desejadas, ou seja, as resultantes da conjugação O meio deve ser seletivo: evitar contaminações e selecionar as transconjugantes

Mas como Meio de seleção ?? O meio deve ser o meio de McConkey com adição de antibióticos Antes da utilização o meio deve ser TESTADO ?? Mas como

Meio de seleção Testemunho: Teste de Viabilidade:

AMARELAS A MUDAR PARA VERMELHO Previsão Quais serão as colónias que serão capazes de se desenvolver no meio de selecção ?? Que cor apresentarão ?? AMARELAS (transconjugantes) AMARELAS A MUDAR PARA VERMELHO VERMELHAS

Colónias Amarelas Recetoras: Degradação progressiva da amoxicilina pelas β-Lactamases provoca níveis cada vez mais baixos de antibiótico As recetoras conseguem desenvolver-se Crescem à volta das verdadeiras transconjugantes Verdadeiras transconjugantes

Colónias Vermelhas Transconjugantes: - Mudança de cor devido à acidificação do meio de cultura (degradação do antibiótico) Dadoras: - Ocorrência de uma mutação espontânea

“As bactérias são melhores engenheiros genéticos que o Homem e vão continuar a escapar ao efeito dos antibióticos.”