Cinética e regulação enzimática

Apresentação em tema: "Cinética e regulação enzimática"— Transcrição da apresentação:

1 Cinética e regulação enzimática
IST – FML 2º Semestre 2007/2008 Trabalho realizado por: Miguel Amador nº58484 Joana Nunes nº58497 João Marques nº58513

2 Cinética Enzimática Estrutura Enzimática Constituição em Aminoácidos
influenciam Mecanismos de Acção Enzimática São difíceis de definir quantitativamente Pelo que é necessário Determinar constantes da reacção catalisada

3 Cinética Enzimática Cinética Enzimática Permite elucidar sobre:
Estudo da velocidade de uma reacção química que ocorre na presença de um enzima Permite elucidar sobre: Os pormenores do mecanismo catalítico das enzimas O papel das enzimas no metabolismo Controle da actividade Mecanismos de inibição

4 Velocidade vs. Concentração
A concentração de substrato influencia a velocidade de uma reacção Estudo da relação entre a concentração e a velocidade: . No inicio da reacção a quantidade de substrato é constante, já que a quantidade de substrato é muito maior do que a de enzima. .Determina-se a velocidade inicial de reacção, Vo ,para uma determinada [S]. .Obtêm-se valores para várias concentrações de substrato, mantendo constante a concentração de enzima. Assim podemos traçar os valores num gráfico, em que exprimimos Vo como função de [S]

5 Velocidade vs. Concentração
Dados: Para [S] baixas, Vo aumenta quase linearmente Para [S] maiores, Vo aumenta mais gradualmente Para [S] mais elevadas, atinge-se uma velocidade máxima, Vmáx.

6 Equação de Michaelis-Menten
Comportamento é explicado pela formação do complexo enzima-substrato ES 1. O enzima liga-se ao substrato reversivelmente formando o complexo ES Reacção rápida 2. O complexo ES dissocia-se em enzima livre e produto da reacção Reacção mais lenta .A reacção 2, mais lenta, limita a velocidade global da reacção. .A velocidade é proporcional à concentração do complexo ES. .A cada momento o enzima existe na forma livre e no complexo ES. .A velocidade máxima (Vmáx) da reacção ocorre quando todos os enzimas estão associadas a moléculas de substrato.

7 Dedução da Equação Michaelis-Menten
A curva que representa a relação entre [S] e Vo tem forma idêntica para a maior parte dos enzimas. Esta curva pode ser descrita algebricamente pela equação de Michaelis-Menten. A equação de Michaelis-Menten é Hipótese: o passo limitante da velocidade das reacções enzimáticas é a desassociação do complexo ES

8 Dedução da Equação Michaelis-Menten
Presuposto: não há transformação de produto em substrato Reacções de formação e desassociação do complexo ES: Vo pode ser considerado como a velocidade com que ocorre a quebra da ligação ES Não é fácil determinar [ES]! [ET] - concentração total da enzima A concentração de enzima livre é, assim, [ET]-[ES]

9 Dedução da Equação Michaelis-Menten
.Passo 1 Velocidade de formação de ES Velocidade de degradação de ES .Passo 2 [ES] é constante, ou seja, a velocidade de degradação e formação de ES são iguais. .Passo 3

10 Dedução da Equação Michaelis-Menten
.Passo 4 Obtemos Vo, substituindo [ES] A velocidade é máxima quando [ES]=[ET]! Equação de Michaelis-Menten

11 Análise da Equação Michaelis-Menten
A equação de Michaelis-Menten, que nos dá a relação quantitativa entre a velocidade inicial V0, a velocidade máxima Vmáx e a quantidade inicial de substrato [S], todas relacionadas pela constante de Michaelis Km Km – unidades de concentração No caso de V0 ser exactamente metade de Vmax: Km corresponde à concentração de substrato para a qual V0 é metade da velocidade máxima

12 Análise da Equação Michaelis-Menten
A equação de Michaelis-Menten é muito útil para determinar os valores de Km e Vmáx das reacções. Os enzimas que exibem uma dependência hiperbólica de V0 em função de [S] diz-se que seguem a cinética de Michaelis-Menten. Enzimas cujo mecanismo obedeça às duas reacções anteriores podemos dizer que o valor de Km está relacionado com a afinidade do enzima para o substrato, e logo é diferente de substrato para substrato e de enzima para enzima. O Vmáx é a velocidade máxima que a reacção pode alcançar, na situação virtual em que todos os enzimas se encontram ligados ao substrato.

13 Equação de Lineweaver-Burk
Podemos transformar a equação de Michaelis-Menten, invertendo-a: Esta forma da equação de Michaelis-Menten chama-se equação de Lineweaver-Burk

14 Obtém-se uma função linear!
Equação de Lineweaver-Burk Gráfico de 1/[V0] em função de 1/[S] Obtém-se uma função linear! .Esta recta tem um declive Km/Vmáx .A intersecção da recta no eixo 1/V0 corresponde ao valor 1/Vmáx .A intersecção com o eixo 1/[S] corresponde a -1/Km Permite uma determinação de Vmáx precisa!

15 Reversível Irreversível Inibição enzimática Competitiva
Anti-Competitiva Mista Irreversível

16 Há competição pelo centro activo do enzima
Inibição Reversível Competitiva Há competição pelo centro activo do enzima O inibidor é estruturalmente semelhante ao substracto A inibição pode ser contrariada adicionando mais substracto ao meio O Km aumenta e o Vmax não se altera

17 Inibição Reversível Competitiva

18 Inibição Reversível Competitiva

19 Inibição Reversível Competitiva

20 O inibidor liga-se a um local específico do
Inibição Reversível Anti-Competitiva O inibidor liga-se a um local específico do enzima (que não o centro activo) O inibidor liga-se apenas ao complexo ES, formando o complexo ESI O Km diminui e o Vmax diminui

21 Inibição Reversível Anti-Competitiva

22 Inibição Reversível Anti-Competitiva

23 Inibição Reversível Anti-Competitiva

24 O inibidor liga-se a um local específico do
Inibição Reversível Mista O inibidor liga-se a um local específico do enzima (que não o centro activo) O inibidor liga-se tanto ao enzima livre como ao complexo ES Vmax diminui Km pode aumentar, diminuir ou manter-se

25 Inibição Reversível Mista

26 Inibição Reversível Mista

27 Inibição Reversível Mista

28 Inibição Reversível Quando α = α’, a Inibição Mista tem o nome de
Vmax aparente Km aparente Sem inibição Vmax Km Inibição competitiva αKm Inibição Anti-Competitiva Vmax/α’ Km/α’ Inibição Mista αKm/α’ Quando α = α’, a Inibição Mista tem o nome de Inibição Não Competitiva

29 O inibidor combina-se permanentemente ao
Inibição Irreversível O inibidor combina-se permanentemente ao enzima de uma das seguintes formas: Ligação covalente Destruição de um grupo funcional essencial ao funcionamento do enzima Ligação não covalente particularmente estável

30 Hexocinase A hexocinase fosforila a glucose para glucose-6-fosfato
Reacção ocorre com consumo de ATP juntamente com um ião Mg2+ O Km para a glucose é 0.1mM, e a concentração de glucose na célula é 4mM A hexocinase é regulada alostericamente pelo produto da sua própria reacção

31 Hexocinase A hexocinase é uma enzima do tipo indutivo

32 Hexocinase Fosforilação impede a saída de glucose da célula

33 Hexocinase Reacção catalisada pela hexocinase

34 Hexocinase No fígado também existe uma hexocinase, mas com
menor afinidade para com a glucose Esta só está activa quando a concentração de glucose no sangue é muito elevada Quando a concentração de glucose no sangue é baixa, o fígado não compete com outros tecidos No fígado, a glucose é convertida em glicogénio

35 Hexocinase glucose ocorre no fígado durante a gluconeogénese.
A fosforilação da glucose é reversível! A conversão da glucose-6-fosfato em glucose ocorre no fígado durante a gluconeogénese.

36 Fazem normalmente parte de sequências metabólicas.
Enzimas Reguladores Enzimas que aumentam ou diminuem a sua actividade em reacção a determinados factores. Fazem normalmente parte de sequências metabólicas. Permitem regular a actividade de toda a sequência metabólica e possibilitam à célula ajustar-se às suas necessidades energéticas e biomoléculares.

37 Tipos de Moduladores Mecanismos que regulam a actividade enzimática:
Variação da concentração de substrato Variação de pH e temperatura Inibição enzimática Modulação covalente Modulação alostérica

38 Modulação alostérica Modulador alostérico
Ocorre em enzimas que possuem um local de modulação alostérico Heterotropismo (o modulador é diferente do substrato) Homotropismo (o modulador é igual ao substrato) Modulador alostérico Negativo (inibe o enzima) Positivo (activam o enzima) A ligação entre o modulador e o enzima é não-covalente e o local de modulação é especifico para cada modulador, no caso dos enzimas heterotrópicos

39 Modulação alostérica Induz:
Modificações conformacionais na estrutura espacial do enzima Modifica a afinidade do enzima para com os seus substratos

40 Modulação alostérica Um modelo muito comum de regulação alostérica é a inibição por retroalimentação, onde o próprio produto da reacção actua como modulador da enzima que a catalisa.

41 Cinética Não seguem a cinética de Michaelis-Menten
Comportamento sigmóide [S] para a qual V0=Vmáx/2 não corresponde ao Km O comportamento sigmóide é explicado pela interacção entre as subunidades das proteínas, já que mudanças estruturais numa subunidade são transferidas para as adjacentes, através de interacções não covalentes entre elas.

42 Cinética Enzimas homotrópicas pequenas variações na concentração do modulador podem provocar grande variações na actividade do enzima. Enzimas heterotrópicasÉ dificil generalizar a forma como se comportam . Apresentam uma grande variabilidade no comportamento.

43 Cinética

44 Modulação covalente Grupos adicionados ou retirados do enzima através de modificações covalentes Fosforilação Adenilação Urinilação ADP-ribosilação Metilação

45 Fosforilação Ligação de um grupo Fosforil a determinados resíduos de aminoácidos É catalisada por quinases É um processo reversível Fosfatase remove os grupos fosforil adicionados

46 Fosforilação O grupo fosforil:
Influencia a polaridade dos aminoácidos Permite o estabelecimento de pontes hidrogeniónicas Importantes para a estrutura e conformação da molécula

47 Adenilação É adicionado um grupo Adenil à tirosina

48 Uridilação É adicionado um grupo uridil à tirosina

49 ADP-Ribosilação É acresentada uma ADP-Ribose, com incidência nos resíduos Arginina, Glutamina, Cisteína e Histidina alterada (diftamida-a)

50 Metilação É adicionado um grupo metil em resíduos de glutamato

51 Zimogénios Zimogénio Enzima activa
A regulação enzimática pode passar ainda pela existência de um precursor, sem capacidade catalítica, que, no caso das proteases, são chamados zimogénios. Clivagem proteolítica Zimogénio Enzima activa