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Lilian Castilho, PhD Sistema Rh Simpósio Hemopasso Passo Fundo, 24 a 26/03/2008.

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1 Lilian Castilho, PhD Sistema Rh Simpósio Hemopasso Passo Fundo, 24 a 26/03/2008

2 Sistema Rh Sistema Rh Sistema complexo 49 antígenos muitos fenótipos no mínimo 200 alelos um fenótipo pode gerar vários genótipos Principais antígenos D; C/c; E/e 8 haplótipos: Dce(R 1 ),Ce(r), DcE(R 2 ), cE(r), Dce(R 0 ), ce(r), DCE(R Z ), CE(r y )

3 Sistema Rh:Terminologia Sistema Rh:Terminologia Rh não Rhesus Sistema ISBT: 004 Símbolo ISBT: RH Fenótipo: D+C+E-c+e+ RH:1,2-3,4,5 Dce/ce ou Dce/dce=R 1 r Provável genótipo: DCE/ce, RH * 1,2,5/RH*4,5 ou R 1 r

4 Questões frequentemente realizadas Questões frequentemente realizadas 1.Por que RhD é tão imunogênico? Principal causa da DHFR 40-75% dos D- tornam-se aloimunizados quando expostos a hemácias D+ 2.Por que o sistema Rh é tão complexo? - Número elevado de antígenos D, C/c, E/e (comuns) ~outros 40 Variantes - Diferenças na expressão de D D positivo ou D negativo? - D fraco - D parcial 3.Por que grupos étnicos Africanos/ Hispânicos desenvolvem anticorpos RhD complicados? Anti-D em D+, D fraco

5 Locus RH Duplicação de 2 Genes antígeno D antígenos CcEe ce Rh negativo Deletado X Europeus % X Rh positivo RHD RHCE ce, Ce, cE, or CE Circulos- representam diferentes amino acidos entre RhD e RhCE RhCE RhD C/cE/e 1. Esta diferença explica por que RhD é tão imunogênico Maioria dos antígenos de grupos sanguíneos diferem em um (ou poucos) aa

6 2. Por que o sistema Rh é tão complexo ? antígeno D antígenos CcEe RHD 53 RHCE 5 3 ce, Ce, cE, or CE - Localização no cromossomo- genes muito próximos - Orientação – final 3 face a face um com outro 5 RHD 5 RHCE 3 3 Durante a replicação cromossômica formação de hair-pins trocas ocorrem - um atua como template para a porção do outro Conversão gênica Principal causa para a diversidade RH

7 Diferenças na expressão de RhD Diferenças na expressão de RhD D-positivo – Maioria tem o gene RHD – MAS HÁ EXCEÇÕES D-negativo % Europeus- devido a deleção RHD 3-7% Africanos, 0.5-1% Asiáticos – devido a mutações RHD D Fraco – requer teste indireto da antiglobulina para detecção trocas de único amino ácido (transmembrana) diminuição na QUANTIDADE DE RhD 53 tipos de D fracos diferentes D el - expressão muito fraca de D- não detectável por sorologia adsorve e elui anti-D mais comum em populações Asiáticas D Parcial – epítopos de D alterados tipam como D+ mas desenvolvem anti-D Causas – Troca de único amino ácido na superfície da hemácia - Parte do gene RHD substituído pelo RHCE

8 1.Alguns são difíceis de detectar com reagentes sorológicos Discrepâncias na tipagem: D- com um reagente; D+ com outro Se unidades de sangue de doador são rotuladas como D- podem estimular anti-D em receptores D- Exemplos: D Fraco tipo 2 D Fraco com RHCe em trans D el - nenhum reagente detecta Problemas devido a D Fraco e D el RhD Fraco V270G Tipo 1 2. Alguns pacientes desenvolvem anti-D Preconizado- maioria dos pacientes com D fraco não desenvovem anti-D - altera quantidade da proteína, mas não os epítopos D da supefície - Não é regra para todos os tipos de D fracos – difícil de pré determinar

9 Proteína D Fraco RhD: a sítios/hemácias D Fraco: densidade antigênica varia de acordo com o tipo de D fraco: 66 a sítios/hemácia tipo 4 tipo 3 tipo 1 tipo 2 tipo 5 Cut off sorológico= 500 ags/hemácias D fraco tipo 5: geralmente tipados como RhD-negativo

10 Proteína D el RhD: a sítios/hemácias D el : densidade antigênica: < 50 sítios/hemácia Cut off sorológico=500 ags/hemácias D el : geralmente tipados como RhD-negativo DEL encontrado nos raros Asiáticos RhD-negativos e são C+ ou E+

11 Hemácias D Parcial ti pam como D+ e não são identificadas até que o paciente desenvolva anti-D possuem epítopos de D alterados Problemas com D Parcial NH2 DMH- L54P DFW- H166P D HMi - T283I D II - A354D D VII - L110P DHR- R229K DNU-G353R DNB- G355S - Devido a mutações localizadas na região extracelular - Devido a proteínas RhD/RhCE híbridas DIII DIV DV DVI DBT DAR DOL DAU etc.

12 Proteína D Parcial RhD: a sítios/hemácias D parcial: densidade antigênica: 500 a sítios/hemácia D Cat VI e DAR: podem ser tipados como RhD-negativo

13 Tipagem RhD: positivo ou negativo? * até resolver a discrepância: painel de monoclonais ou genotipagemAnti-D#1(IgM)Anti-D#2(IgM)ResultadoTransfusãoPOSPOSRhD+RhD+ NEGNEGRhD-RhD- POSNEGDF/DP?RhD-* NEGPOSDF?DP?RhD-* Pacientes

14 Tipagem RhD: positivo ou negativo? * genotipagem? ** até resolver a discrepância: genotipagemAnti-D#1(IgG/AGH)Resultado Transfundir para pacientes POSRhD+RhD+ NEGRhD-RhD-* POS Fraco DF/DP?RhD-** Doadores Voce sabe qual é sua unidade RhD- negativo?

15 D Fraco ou D parcial?

16 Identificação em gel Identificação em gel Painel com 12 soros monoclonais (DII, DNU, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT, DHAR, DAR, DCS, DOL, DHK/DAU-4, Weak D 5,7, Weak D type 38) Painel com 12 soros monoclonais (DII, DNU, DIII, DIV, DV, DVI, DVII, DFR, DBT, DHAR, DAR, DCS, DOL, DHK/DAU-4, Weak D 5,7, Weak D type 38) D Fraco ou D parcial?

17 D Fraco ou D neg?

18 D Fraco

19 D-neg, D fraco ou D el ? – D conf.

20 D-neg, D fraco ou D el ? – D Fraco tipo 38

21 D-neg, D Fraco ou D el ? DEL RHD(M295I)

22 D Fraco IgG IgM PAP DF1 DF4 DVI

23 Problemas nos testes sorológicos Testes sorológicos não distinguem D fraco de D parcial com fraca expressão Testes sorológicos não detectam alguns D fracos, D el e D parcial

24 Testes sorológicos associados a testes moleculares auxiliam na identificação de variantes do antígeno D D Fraco e D parcial Imunizam receptores D-negativos Desenvolvem anti-D

25 Casos enviados ao nosso laboratório para genotipagem RHD (2007) Tubo Gel Variações de D IgM Poli DVI+ DVI- Dconf. DF1 0/(+) 0/1+ 0/2+ 0/1+ 1+/3+ DF / /3+ DF3 0/2+ 0/ DF4 0/2+ (+)/3+ 1+/3+ 4+ DVI 0/1+ 0/ /4+ DF1+DF2 0/ (+)/2+ 3+ DF1+DF4 0/2+ 0/1+ (+)/4+ 4+ DF1+DF2+DF

26 AmostrasTipos de D fraco e D parcial Graus de aglutinaçãoDensidades antigênicas Anti- D mono (gel) Anti-D conf (gel) 9DF DF DF DF DAR DHMi DVI(+) DF1/DHMi(+) DF4/DAR(+) Reagentes anti-D na detecção de D fraco e D parcial

27 Genotipagem RHD em doadores de sangue Indicações: Indicações: Discriminar D neg de DEL e D pos Discriminar D neg de DEL e D pos Discriminar D parcial e D Fraco Discriminar D parcial e D Fraco Limitações Limitações Custo Custo Tempo Tempo Imunogenicidade de DEL? Imunogenicidade de DEL? Quem deveria ser testado? Quem deveria ser testado? Doadores de primeira vez Doadores de primeira vez Doadores de repetição (discrepâncias) Doadores de repetição (discrepâncias) Esta unidade é RH compatível?

28 Aplicações clínicas Genotipagem RH Pacientes com fenótipos D fraco Pacientes com fenótipos D fraco D fracos mais frequentes devem ser transfundidos com hemácias RhD pos (3 a 6% das unidades RhD-neg são preservadas) D fracos mais frequentes devem ser transfundidos com hemácias RhD pos (3 a 6% das unidades RhD-neg são preservadas) Doadores de sangue Doadores de sangue Triagem para DEL e D fraco entre doadores sorológicamente D neg (prevenção da aloimunização) Triagem para DEL e D fraco entre doadores sorológicamente D neg (prevenção da aloimunização)

29 Fenótipo D fracoTransfusão D fraco tipo 1RhD-positivo D fraco tipo 2RhD-positivo D fraco tipo 3RhD-positivo D fraco tipo 4.0RhD-positivo D fraco tipo 4.1RhD-positivo D fraco tipo 4.2RhD-negativo D fraco tipo 5RhD-negativo D fraco tipo 11RhD-negativo D fraco tipo 15RhD-negativo Outros tiposRhD-negativo Recomendações clínicas para pacientes com o fenótipo D fraco

30 Caso Clínico Paciente Afro brasileira, sexo feminino, 36 anos com sangramento vaginal Paciente Afro brasileira, sexo feminino, 36 anos com sangramento vaginal Solicitado 2 unidades de sangue Solicitado 2 unidades de sangue 2 gestações 2 gestações Tipada como O RhD+ Tipada como O RhD+ Anti-D fraco detectado no soro Anti-D fraco detectado no soro Sem história de profilaxia Rh (óbvio!) Sem história de profilaxia Rh (óbvio!)

31 Anti-DD III D IV DVDV D VI D VII DARDFRPaciente 1+++/ / / Soro testado com painel de 6 monoclonais para detectar D parcial Caso Clínico

32 Suspeitas: Suspeitas: D Normal – mas por que o anticorpo? D Normal – mas por que o anticorpo? D III ? D III ? D VII ? D VII ? Outro D parcial? Outro D parcial? Análise Molecular – screening rotina mostou RHD normal Análise Molecular – screening rotina mostou RHD normal Nenhum gene híbrido presente Nenhum gene híbrido presente Caso Clínico

33 Análise do DNA PCR-SSP para DVII: negativo PCR-SSP para DVII: negativo PCR-RFLP para DIIIa: positivo PCR-RFLP para DIIIa: positivo DIIIa! DIIIa! Paciente possuía o fenótipo D parcial Paciente possuía o fenótipo D parcial Anti-D era um aloanticorpo Anti-D era um aloanticorpo Paciente ficou muito brava porque seu tipo de sangue estava errado! Paciente ficou muito brava porque seu tipo de sangue estava errado!

34 Caso Clínico Paciente Caucasóide, sexo masculino, suspeita de AHAI Paciente Caucasóide, sexo masculino, suspeita de AHAI PAI positiva, Auto e TDA positivos PAI positiva, Auto e TDA positivos Anti-D detectado no soro e eluato Anti-D detectado no soro e eluato Paciente tipado como D+ Paciente tipado como D+ Anti-D: auto ou alo? Anti-D: auto ou alo? Genotipagem!!!! Genotipagem!!!!

35 Caso Clínico Análise molecular de rotina demonstrou um gene RHD normal Análise molecular de rotina demonstrou um gene RHD normal Nenhum gene híbrido presente, não era DIII e nem DVII Nenhum gene híbrido presente, não era DIII e nem DVII Sequenciamento do gene RHD: normal Sequenciamento do gene RHD: normal Conclusão: auto-anti-D Conclusão: auto-anti-D

36 Caso Clínico Doador com 9 doações prévias Doador com 9 doações prévias Fenotipado como O RhD-neg em todas as doações Fenotipado como O RhD-neg em todas as doações Na 10 0 doação: Suspeita de D Fraco ou Del? Na 10 0 doação: Suspeita de D Fraco ou Del? Genotipagem!!!! Genotipagem!!!!

37 Caso Clínico Análise molecular demonstrou um gene RHD deletado Análise molecular demonstrou um gene RHD deletado Nenhum D fraco, DEL e D parcial detectado Nenhum D fraco, DEL e D parcial detectado Conclusão: Doador RhD-negativo Conclusão: Doador RhD-negativo

38 Muitas regiões do gene devem ser analisadas Muitas regiões do gene devem ser analisadas Geralmente requer sequenciamento do gene inteiro Geralmente requer sequenciamento do gene inteiro Necessidade de genotipagem por microarray Necessidade de genotipagem por microarray Conhecimento das mudanças no gene que alteram os epítopos da proteína = clinicamente significantes Conhecimento das mudanças no gene que alteram os epítopos da proteína = clinicamente significantes Problemas para resolver variantes RHD

39 Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos com um gene híbrido D-CE-D específico Este haplótipo RH é frequente em pacientes falciformes aproximadamente 22% Africanos 15 % Fenótipo C positivo; desenvolve anti-C Gene híbrido D-CE-D associado a variante e; desenvolve anti-e L245V ce s W16C D/Ce/D híbrido: D-negativo C-positivo RHD RHCE Variante ce Variantes RHCE Problemas na fenotipagem do ant í geno C

40 Frequentes em pacientes falciformes G336C L245V ce s W16C V223F ceMO W16C M238V L245V R263G M267K I306V ceAR W16C M238V A273V L378V ceBI W16C ceEK M238V R263G M267K W16C ce convencional Muitos genes diferentes, todos com expressão alterada do antígeno e Fenótipo e-positivo Desenvolvem anti-e e/ou anti-ce Em Africanos, Hispânicos, e grupos étnicos mistos Variantes RHCE Problemas na fenotipagem do ant í geno e

41 Antígenos Rh (D, C/c, E/e) são resistentes ao tratamento por enzimas, DTT, cloroquina Antígenos do Sistema Rh Anticorpos do Sistema Rh Alo-anticorpos anti-D, -E, -c, -C, -e IgM ou IgG reativos a 37 o C, AGH, enzimas clinicamente significantes Auto-anticorpos frequentes (anti-e)

42 Anticorpos do Sistema Rh Alo-anticorpos anti-C associado a anti-G Anti-C associado a anti-e anti-E associado a anti-c anti-e detectado em hemácias e-positivas

43 PerspectivasGenótipoFenótipo aglutinação DNA + Tipagem RhD: positivo ou negativo?

44 Obrigado pela atenção!


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