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Desenvolvimento de Métodos Bionalíticos Aplicação em HPLC Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Março 2004.

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Apresentação em tema: "Desenvolvimento de Métodos Bionalíticos Aplicação em HPLC Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Março 2004."— Transcrição da apresentação:

1 Desenvolvimento de Métodos Bionalíticos Aplicação em HPLC Farmacologia Clínica Universidade Mogi das Cruzes Março 2004

2 Princípios Gerais Em uma análise quantitativa de fármacos em matriz biológica deve-se tomar cuidado em todas as etapas, para evitar erros. A amostra a ser analisada deve ser representativa do total; não deve haver perdas e nem contaminações durante seu preparo. A etapa de separação dos componentes da amostra no cromatógrafo também pose ser fonte de erros como:

3 Adsorção irreversível de parte da amostra na fase estacionária Resposta do detector afetada por alterações de temperatura e vazão Quantidade de amostra injetada for da faixa linear do detector e etc.

4 Após a obtenção do cromatograma, faz a in- tegração dos sinais, que tem por finalidade trans- formar a intensidade do sinal emitido pelo detector em uma medida relacionada com a quantidade da substância analisada na amostra. A integração dos sinais pode ser feita usando os seguintes métodos:

5 Altura do pico: Este método não é muito usado porque sofre influência de variações instrumentais. Trata-se de uma perpendicular à linha de base passando pela inflexão máxima do pico; a medida desde a linha de base até este ponto de inflexão máxima deste pico; corresponde a altura do pico.

6 Área do pico: Pode-se calcular a área do pico traçando -se tangentes nos dois lados do pico; a intersecção destas duas tangentes com a linha de base fornece um triângulo cuja área pode ser calculada pela fórmula:

7 A = a x w 2 Onde: A = área do pico a = altura do pico w = largura do pico na linha de base

8 A área também pode ser calculada utilizando- se a largura na meia meia altura, isto é, formando um triângulo na metade superior do pico. Neste caso, a area é calculada: A = a x w H onde: W H = largura do pico na meia altura

9 12 3 a a w a2a2 WHWH Métodos para a integração dos sinais fornecidos pelo registrador: 1. altura pelo pico 2. área do pico 3. área na meia altura

10 Com base nas medidas obtidas na integração, estas poderão ser relacionadas com a concentração de uma dada substância na amostra, através dos seguintes métodos :

11 Normalização: Este método requer que todas as substâncias presentes na amostra sejam eluídas, e que a resposta do detector seja idêntica para todas. Consiste em comparar a área obtida no cromatograma com a porcentagem da composição da mistura.

12 % A = área A x 100 área total

13 Fator de resposta: Se o detector não responde de maneira similar para todas as substâncias presentes na amostra, é necessário corrigir esta equação usando o chamado fator de resposta que é determinado como a porcentagem conhecida e observada para cada composto. Assim por exemplo: f A = % A conhecida % A observada

14 Para calcular a porcentagem da substância presente na amostra, basta multiplicar a área obtida pelo fator de resposta e dividir pela somatória de todas as áreas multiplicadas pelos respectivos fatores de resposta.

15 Calibração externa : Este método compara a área da substância a ser quantificada na amostra com as áreas obtidas desta mesma substância em soluções padrão de concentrações conhecidas. Dessa forma obtém-se um gráfico, relacionando as áreas obtidas com as concentrações estabelecidas.

16 Utilizando este gráfico, pode-se calcular a concentração desta substância com a amostra. Este método é sensível a erros de injeção das soluções padrão e das amostras, bem como a erros relacionados com a preparação dos padrões.

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18 Padronização interna: Consiste em adicionar uma quantidade conhecida de uma sunstância padrão na amostra a ser analisada, e relacionar ad duas áreas resultantes. Normalmente, uma substância empregada como padrão interno deve possuir características:

19 – mesma similaridade à substância em análise – ter concentração e tempo de retenção a substância em exame – inerte – não fazer parte da amostra analítica – ter um perfil cromatográfico característico e diferente das demais substâncias presentes na amostra

20 Após a análise dessas substâncias constrói-se um gráfico, relacionando a razão de áreas (Ax/Api) com a concentração desta substância. Através da razão de áreas obtidas no cromatograma tem-se a concentração da substância na amostra, utilizando o gráfico da calibração externa.

21 Este método é menos sensível a erros de injeção, variações instrumentais, etc. É o melhor método para análise quantitativa.

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23 General Procedure of Liquid/Liquid Extraction Applied Bioequivalence Studies

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28 Phase Solid Extraction

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37 Quantitative Determination of Drugs in Serum by HPLC Applied Bioequivalence Studies

38 Determination of diclofenac in Human Plasma by HPLC Method: System Chromatography: consisted of a LKB-Bromma 2150 HPLC, pump coupled to a VWM 2141 dual wavelenght UV detector (Pharmacia-LKB,Uppsala, Sweden). The output sinal was registered in a Nryans chart recorder ( Bryan Souththern Instruments, Kent, Great Britain)

39 Mobile Phase: acetonitrile;water (40:60, v/v) and 0.1 mol/L acetic acid solution; the pH was ajusted to 5.6 with 3 mol?L sodium hidroxide. Flow rate: 2.3 mL/min Column Chromatography: Spherisorb ODS-25mm, 4.6 mm x 250mm Sigma Aldrich (ST. Louis,MO,USA Detection: 276nm (U.V absorbance)

40 500 µL calibretion point or serum sample ng Indometacina (I.S) µL of 5% phosphoric acid 4 mL Dicloromethane Phase organic washed with 200 µL amonium acetate 1:20 in water Brief vortex mixing Extraction Procedure Vortex mixing 1 min Centrifuged 2000 rpm 10 min Centrifuged 2000 rpm 2 min

41 Organic Phase 45 ºC under nitrogen stream The residue 100 µL of acetonitrile Analytical Sample 20 µL

42 Determination of Terbinafine in Human Plasma by LC/MS-MS Method: System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser, thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped with a electrospray source. Mobile Phase: Acetonitrile:water (80:20) containing 10 mmol/L formic acid

43 Flow rate: 0.50 mL/min Column Chromatography: Genius C 18 4um analytical column (150 mm x 4.6 mm i.d) 40°C Detection: The Quatro II equipped with a electrospray source using a crossflow counter electrode in mode (ES+) and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 292.2>140.7 and >116.9 for terbinafine and naftifine, repectively. The cone voltage and collission energy were 35V and 15 eV for terbinafine and 12 eV for naftifine.

44 200 µL calibretion point or serum sample + 20 µL Naftifine ( 1 µg/mL methanol: water 50:50) 4 mLDiethyl Ether:Hexane (80:20) Organic Phase 37 ºC under nitrogen stream Brief vortex mixing Extraction Procedure Vortex mixing 1 min Centrifuged 2000 rpm 10 min

45 The residue 200 µL of acetonitrile: water (80:20) containing 10 mmol/L formic acid Analytical Sample 50 µL

46 Determination of Fluconazole in Human Plasma by LC/MS-MS Method: System Chromatography: consisted of a Hewlett Packard HPLC, binary pump, autosampler injector, degasser, thermostat column, variable-wavelenght UV, coupled a The Quatro II (Micromass, Altringham, Cheshire UK equipped with a electrospray source. Mobile Phase: Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM acetic acid pH= 3.7

47 Flow rate: 0.9 mL/min isocratic gradient Column Chromatography: Genesis C 18 4um analytical column (10 mm x 4.0 mm i.d) 40°C Detection: The Quatro II equipped with a electrospray source using a crossflow counter electrode in mode (ES+) and mutiple reaction mode (MRM), monitoring 171.8>127.7 and 306.9>219.8 for metronidazole and fluconazole, repectively. The cone voltage and collission energy were 30V and 20eV, respectively.

48 200 µL calibretion point or serum sample µL of carbonate- bicarbonate buffer containing metronidazole (I.S) 1 µg/mL 3 mL Diethyl ether/dicloromethane (70:30) Organic Phase 37 ºC under nitrogen stream Brief vortex mixing Extraction Procedure Vortex mixing 5 min Centrifuged 2000 rpm 10 min

49 The residue Acetonitrile:water (40:60) containing 5 mM acetic acid Analytical Sample 10 µL

50 Propanolol in Serum HPLC Method Column: Symmetric Shield ® RP x 150 mm, 5 µm Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm Mobile Phase: 20mM phosphate potassium, pH 7/methanol 39:62 Flow rate: 1 mL/min Injection volume: 20 µL porcine serum Temperature: 30 Cº Detection: 254 nm (U.V) Components: Propanolol and Butyl Paraben (I.S)

51 Oasis ® HLB Extraction Method Oasis ® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge Condition 1mL methanol/1ml water Load 1mL spicked porcine serum Wash 1mL 5% Methanol in water Eluent 1mL Methanol + 5µg butyl paraben Evaporate and Constitute 40 ºC under nitrogen stream 200µL Methanol

52 Tetracyclines in Serum HPLC Method Sample: 1 mL spicked porcine serum / 2% phosphoric acid solution / demecycline as I.S Column: Symmetric Shield ® RP x 150 mm, 5 µm Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm Mobile Phase: 0.1 % TFA in water Acetonitrile:methanol (91:7:2) Flow rate: 0.9mL/min Injection volume: 20 µL porcine serum Temperature: 30 Cº Detection: 279 nm (U.V)

53 Oasis ® HLB Extraction Method Oasis ® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge Prepare Sample Mix 20µL (H2 PO4) to 1mL serum Condition 1mL methanol Rinse 1mL water Load 1mL sample

54 Elute 1mL Methanol Evaporate to 0.2 mL Reconstitute with mobile phase Wash 1mL 5% Methanol in water

55 Sulfa Drugs in Serum HPLC Method Column: Symmetric Shield ® RP x 150 mm, 5 µm Guard Column: Sentry guard column, 3.9 x 20 mm, 5 µm Mobile Phase: 1% glacial acetic acid and 4% methanol in water Flow rate: 1 mL/min Injection volume: 10 µL porcine serum Temperature: 25Cº Detection: 254 nm (U.V) Components: Sulfadiazine, Sulfathiazole (I.S) and Sulfamerazine

56 Condition 1mL methanol/1ml water Load 1mL spicked porcine serum with 10µg/mL sulfathiazole (I.S), 20 µL phosphoric acid Wash 1mL 5% Methanol in water Oasis ® HLB Extraction Method Oasis ® HLB 1cc/ 30 mg Extraction Cartridge

57 Eluent 1mL Methanol Evaporate and Constitute 40 ºC under nitrogen stream 1mL mobile phase

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