A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e detecção Técnicas tradicionais.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e detecção Técnicas tradicionais."— Transcrição da apresentação:

1 Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e detecção Técnicas tradicionais

2 Dificuldades na avaliação (aula anterior): Falta de recursos humanos capacitados Amplitude da diversidade Erosão da diversidade Falta de metodologias Porquê avaliar? Assegurar que microrganismos desempenhem processos necessários a produtividade e sustentabilidade. Assegurar que pelo menos alguns microrganismos sejam tolerantes a estresses.

3 Amostragem Processamento Detecção e avaliação: - Técnicas Fenotípicas - Técnicas Imunológicas - Técnicas Moleculares

4 Etapa crítica São usados equipamentos especializados Devem ser considerados os seguintes fatores: - Representatividade - Não alterar os números e as atividades - Evitar a introdução de contaminantes - Estocar em condições adequadas

5 Utilizar amostras compostas em ambientes com distribuição heterogênea Determinar o número mínimo de amostras: Os limites de confiança e extrapolações devem ser determinadas estatisticamente. Como minimizar o problema da representatividade

6 Estratégias de amostragem Acesso - direto Número de microrganismos - Baixo Equipamentos Processamento (acoplado) - Concentração em filtros O Ar é um meio restritivo para os microrganismos (*) (*) Apesar de restritivo transmite inúmeros agentes patogênicos Amostragem no

7 Os microrganismos alcançam o ar através dos aerossóis Depende do tipo de microrganismo, partículas e fase gasosa

8 Diferente de outros ambientes, no ar os microrganismos não se multiplicam Morte dos microrganismos no ar: dN/dt = -k.N ou ln(N/No) = -k.t k - coeficiente de inativação (velocidade específica de morte) Depende do tipo de microrganismo e das condições ambientais Fatores ambientais: Umidade relativa Temperatura Radiação (pigmentação, reparo do DNA) Radicais de O 2 Íons

9 Amostragem do ar 2. Simulação respiratória (tamanho partícula 0,8 – 15 μm; velocidade do ar) 3. Colisão - Captura em líquido. Ex: AG Impacto - deposição em superfícies sólidas. Ex: coletor de Andersen 4. Centrifugação 5. Filtração 6. Deposição - Coleta passiva

10 Amostrador de Andersen

11

12 Simulação respiratória

13 Placas após incubação Ágar Sangue Ágar Dextrose

14 Impacto em líquido: AG-30

15 Equipamentos para amostragem do ar: Amostragem passiva Apenas microrganismos que caem nas placas Amostragem ativa Recuperação forçada usando um volume determinado

16 Método usado nas estações espaciais (Dados NASA)

17 Importância Aeromicrobiologia extramuro: Dispersão de patógenos e toxinas (botulínica, estafilocócica, LPS) Fitopatógenos (ferrugem) Doenças pulmonares e gastro-intestinais de animais Despejo de resíduos (sólidos e líquidos) Guerra biológica Aeromicrobiologia intramuro: Edifícios (doenças dos Legionários-Legionella pneumophila, bactéria aquática disseminada pelos aparelhos de ar condicionado e água potável) Viagens de avião Saúde pública - gripes

18 Acesso - Direto ou remoto Números - elevados ou baixos Equipamentos - Recipientes, filtros, ROV Processamento - diluição ou concentração Amostragem na Depende do nível de matéria orgânica

19 Equipamentos ROV (Veículo operado de forma remota) usados nas águas hidrotermais (Yellowstone Park) Águas termais são difíceis de amostrar convencionalmente Robô controlado remotamente abre o recipiente no local de amostragem para não ocorrer contaminação com microrganismos de outras profundidades.

20 Acesso - Remoto Número de microrganismos - elevado Equipamentos - observatórios, sondas Processamento - diluição Amostragem em

21 Microbiota dos sedimentos Cowen, 2004 Existem observatórios penetrando 300 m nos sedimentos e crostas Um método efetivo de acesso ao sedimento enterrado é através de observatórios. Controle da pressão da amostra.

22 Baixa abundância (biomassa), porém microrganismos sempre presentes. Ventarolas marinhas Uso de sondas fluorescentes específicas para rRNA de Archaea e Bacteria e C radioativo para detectar atividade na crosta basáltica oceânica. Fisk et al., 1998.

23 Sedimentos: Elevada diversidade de Bacteria e Archaea 180 reações metabólicas envolvendo N, S e C inorgânico, metais e minerais assim como compostos orgânicos Existência de diversos micro-nichos

24 Acesso - direto Números de microrganismos – normalmente elevado Equipamentos - trados, pás Processamento - diluição Amostragem no

25 Problemas: solo Distribuição dos microrganismos em agrupamentos 1-5 g solo Elevada variabilidade entre amostras Estatística

26 Solo propriamente dito Elevada população devido a riqueza nutricional da rizosfera. BIOMASSA /g Características: 1. Micro colônias (interação ativa dentro das populações) 2. Populações com elevadas velocidades crescimento 3. Modificações ambientais locais 4. Troca genética Elevada diversidade governada pela Lei do Mínimo de Liebig. Subsolo BIOMASSA /g Distribuição não homogênea

27 Alguns números sobre a estrutura do solo

28 Microrganismos no solo Em cada grama de solo tipicamente franco 2,8 X 10 5 m 2 - dimensões continentais para microrganismos > 1X células viáveis > 4 X10 3 espécies < 0,1% são cultivadas in vitro Maioria dos grupos são conhecidos apenas por informações de sequenciamento de DNA Poucos membros cultivados pertencem a ordens conhecidas Maioria diversidade é desconhecida!

29 Macrofauna e flora são relativamente fáceis de identificar e expressar usando riqueza específica e outros índices. Mas as estimativas da diversidade microbiana são difíceis: heterogeneidade, grupos difíceis de cultivar em meio de cultura Estratégias FAME (ésteres metílicos de ácidos graxos) CHO (carboidratos) Técnicas moleculares usando PCR Sorologia Solo

30 Populações /g Importantes patogênicos para homem Amostragem no

31 Cerca de 40 % da água consumida pelo homem provem de fontes subterrâneas Existem gradientes nestas regiões que causam a movimentação dos microrganismos, como quando a água é movimentada em grandes volumes. Vírus, bactérias e protozoários tem diferentes dimensões, metabolismos, mecanismos de sobrevivência e mecanismos de transporte diferenciados. Estudo da diversidade da microbiota da subsuperficie é muito complexa.

32 Microbiota do subsolo Pesquisada nas últimas décadas (dificuldades de amostragem) Inúmeros aeróbios oligotróficos: /g Análise comunidades: Archaea e Bacteria Como vivem? Quimioautotróficos e Quimiolitotróficos Metanogênicas (CO 2 ) CH 4 Acetogênicas (HCO 3 - ) acetato Bactérias redutoras de sulfatos (BRS) (SO 4 -2 ) gás sulfídrico

33 A 3,4 Km abaixo da superfície Possibilidades: 1. Foram incorporados nos sedimentos durante a formação das rochas há milhões de anos e sobrevivem em condições nutricionais de dieta mínima. 2. Infiltraram com as águas subterrâneas a partir de águas de superfície. 3. Crescem lentamente a partir de fontes de energia inorgânicas fornecendo carbono orgânico para outros microrganismos na matriz rochosa.

34 1-10 microrganismos por g de rocha (10 9 / g de solo rizosférico) Densidade das comunidades é desconhecida : - Metabolismo microbiano é lento (dificuldade distinguir viável de inviável) - Células inviáveis são fonte nutricional para células viáveis (baixo movimento de água e nutrientes) - Difícil reproduzir as condições das profundezas em laboratório - Recentemente 9000 estirpes do subsolo foram catalogadas. - Peso dos microrganismos subterrâneos pode ser equivalente aos da superfície. Subsolo

35 Plantas - seiva, filosfera, tecidos Animais - sangue, dentes, excrementos, secreções Não destrutivas Amostras

36 Processamento Concentração - centrifugação e passagem por filtros Diluição - diluições seriadas Problemas: Porosidade dos filtros Composição química Problemas: Composição do diluente Tempo de mistura Grau de agitação Muito raramente as populações microbianas ocorrem em concentrações apropriadas para a contagem. Enriquecimento

37 Para microrganismos que metabolizam uma substância particular ou que ocorrem em baixas populações na amostra. Desenvolvido por Beijerinck Consiste na promoção de condições favoráveis específicas para o crescimento de um tipo particular de microrganismo. Ex 1: para isolar um fixador de nitrogênio o meio de enriquecimento não poderá conter uma fonte de nitrogênio. Ex 2: bactéria que degrada naftaleno deve-se cultivar a amostra em um meio cuja única fonte de carbono é o naftaleno. Ex 3: coluna de Winogradsky - enriquecimento de quimiolitotróficos. Ex 4: Para isolar Bacillus formadoras de esporos deve-se aquecer a cultura

38 Detecção dos microrganismos Métodos: Fenotípicos - baseados no cultivo ou avaliação de certas propriedades do microrganismos Imunológicos – baseados nas características sorológicas Moleculares - baseados na constituição genotípica

39 Fenotípicos Métodos baratos e não requerem treinamento diferenciado Cultivo em meio de cultura Detectar grupos que usam determinada substância ou fonte energética e que vivem em determinadas condições físico- químicas. Isolamento cultura pura identificação Ex: Geobacter metallireducens CH 3 COO - + 8Fe H 2 O 2HCO Fe H + Utilizar acetato como única fonte de C permite a detecção de microrganismos que usam ferro como fonte de energia

40 Avaliação da abundância Enumeração Biomassa Atividade Contagem direta Contagem indireta

41 Contagem direta Lâmina Petroff-Hauser ao microscópio Fluorescência, anticorpos Vantagens: Não requerem separação do microrganismo. Fornecem estimativas elevadas Desvantagens: Ás vezes distingue entre viáveis e não viáveis. Não permite análises subsequentes

42 Lâminas para contagem direta

43 Contagem indireta Contagem em placasNMP Técnica de Diluição e plaqueamento

44 Diluição seriada Plaqueamento Amplificação sinal fenotípico colônias

45 Diluições seriadas (resultado)

46 Enumeração NMP

47 NMP – número mais provável

48 Contagem indireta Vantagens: - detecção de viáveis - seletividade (uso de meios específicos) Desvantagens: - permite a contagem de somente alguns tipos - Ausência dos não cultiváveis Bioluminescência: detecta ATP residual Impedância/condutância: microrganismos alteram a corrente elétrica.

49 Avaliação da biomassa Parâmetro importante porque avalia os recursos energéticos disponíveis para a comunidade. Expresso em gramas e pode-se converter em energia: 4,9 Kcal/g peso seco Baseia-se no fato de existir uma correlação direta entre a abundância de um microrganismo com alguma substância característica. Proteína Peptideoglicano Quitina LPS DNA Dentre outros Indireta Direta Filtração Centrifução Pesagem

50 Avaliação da atividade Fotossíntese – taxa de produção primária Respiração - consumo de O 2 ou produção de CO 2 Potencial heterotrófico - taxa de absorção de substâncias marcadas com radioisótopos Atividade enzimática - lacase, celulase, nitrogenase, amilase...

51 Viáveis mas não cultiváveis (VNC) Os microrganismos que não são cultiváveis, mas são viáveis, se denominam VNC e requerem técnicas apropriadas para sua detecção. Ex: Fungos micorrízicos vesículo-arbusculares.

52 Outras técnicas fenotípicas MARA - multiple antibiotic resistance activity CSU - carbon source utilization Detecção de hospedeiros de vírus FAME - Fatty acids methyl ester analysis

53 Perfil lipídico - FAME Tem sido usado no estudo da diversidade microbiana em sistemas de tratamento de esgoto, em solos contaminados e biofilmes de sistemas de distribuição de água. Existe variabilidade no perfil da composição e proporção de ácidos graxos das membranas, os quais podem ser comparados com dados catalogados. Após comparação, identifica-se os microrganismos desconhecidos.

54 Detecção com corantes vitais e fluorescência População mista de Micrococcus luteus e Bacillus cereus com células vivas em verde. Corantes DAPI, fluoresceina e vermelho Texas. Corantes ácidos de núcleo: DAPI e verde SYTOX. Células danificadas exibem fluorescência verde.


Carregar ppt "Avaliação da diversidade microbiana Amostragem, processamento e detecção Técnicas tradicionais."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google