PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

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1 PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

2 INTRODUÇÃO

3 Constituição e estrutura das PROTEÍNAS
Aminoácidos (aa) com elevada massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as proteínas. Os 20 aa das proteínas se diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o caráter ácido ou básico do aa em solução. Estrutura (quatro níveis) : Estrutura primária: refere-se à sequência dos aminoácidos na cadeia linear peptídica. Estrutura secundária: refere-se ao grau de ordenação espacial da cadeia polipeptídica. São estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.

4 Estrutura terciária: refere-se ao arranjo espacial obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundária. Envolve a otimização de várias interações (hidrofóbicas, eletrostáticas e de van der Waals) e pontes de hidrogênio entre vários grupos na estrutura da proteína. As estruturas secundária e terciária conferem à proteína a sua estrutura tridimensional. Estrutura quaternária: envolve a associação de subunidades terciárias de proteínas. Para sua estabilização concorrem ligações iônicas, pontes de hidrogênio, forças de van der Waals, pontes bissulfeto e interações hidrofóbicas.

5 Representação esquemática das estruturas das proteínas
Estrutura terciária Estrutura primária Estrutura secundária Estrutura quaternária

6 Princípios de Solubilidade
Solubilidade: resultado global das interações atrativas e repulsivas entre moléculas do solvente e do soluto; É favorecida quando há interações repulsivas entre moléculas de soluto e atrativas entre moléculas do soluto e do solvente; Interações entre soluto e solvente são não covalentes => interações eletrostáticas e forças de Van der Waals; Interações eletrostáticas: base da solubilidade de moléculas polares neutras e com cargas em solventes polares;

7 Regiões Hidrofóbicas (Apolares)
Solubilidade de Proteínas Determinam a solubilidade Regiões Hidrofóbicas (Apolares) Regiões Hidrofílicas (Polares) Além dos aa, íons ferro e cobre, oligossacarídeos e lipídeos conferem diferentes solubilidades às proteínas.

8 pH: grande influência => altera o grau de dissociação dos grupamentos;
Carga total zero leva a um aumento da agregação devido à menor repulsão. perfis de solubilidade em diferentes valores de pH O ponto de solubilidade mínima é igual ou próximo ao ponto isoelétrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a proteína possui carga global igual a zero.

9 pH e distribuição de cargas:
pI - - + + De modo geral, o solvente é aquoso, e, alterando-se as propriedades do meio por mudanças na força iônica e no pH, por adição de solventes orgânicos miscíveis e polímeros orgânicos, altera-se a solubilidade das proteínas.

10 Desnaturação X Precipitação
A desnaturação compreende a destruição da estrutura terciária de uma molécula de proteína e a formação de cadeias polipeptídicas ao acaso. - as variáveis pH, temperatura e solventes orgânicos, dependendo dos valores, causam desnaturação das proteínas. A precipitação compreende a modificação da estrutura tridimensional da molécula de proteína. - as mesmas variáveis, dependendo dos valores, causam precipitação das proteínas.

11 PRECIPITAÇÃO Uso: purificação de proteínas de diferentes fontes
Precipitados: agregados protéicos de moléculas de diferentes tamanhos; Precipitação: operação na qual uma perturbação, química ou física, em uma solução, promove a formação de partículas insolúveis; Remoção do precipitado: separação sólido-líquido; Tradicionalmente usado também como etapa de concentração; Etapa preliminar em diversos procedimentos de purificação; Pode se empregada como etapa única;

12 Vantagens: Facilidade de operação Equipamentos relativamente simples Facilidade de ampliação de escala Grande número de agentes precipitantes (sendo muitos de baixo custo ou usados em concentrações pequenas)

13 As técnicas de precipitação se dividem basicamente em dois grupos:
Redução da solubilidade da molécula alvo pela modificação da solução: Adição de sais (sulfato de amônio) em altas concentrações, de solventes orgânicos (etanol, éter e acetona) e de polímeros não-iônicos (polietilenoglicol). Redução da solubilidade por alterações da molécula alvo: Mudança da carga das proteínas (adição de ácidos e bases), uso de precipitantes aniônicos ou catiônicos.

14 A precipitação deve permitir que a conformação adequada da proteína seja recuperada, para que esta possa “exercer” sua função bioquímica após o processo.

15 PRECIPITAÇÃO POR SAIS Neutralização das cargas superficiais com redução da camada de hidratação => agregação dos resíduos hidrofóbicos Salting-out: adição de sais que promovem o aprisionamento de moléculas de água, que tornam-se escassas, e o consequente consumo das moléculas de água nas regiões hidrofóbicas. Estas, expostas, se interagem e se agregam.

16 Região Hidrofóbica (Apolar)
Regiões Hidrofílicas (Polares)

17 Sais mais adequados são aqueles que apresentam elevada solubilidade.
Os mais usados são: citrato de sódio sulfato de sódio sulfato de amônio

18 Salting-in: em baixa concentração de sais ocorre a indução de interações iônicas e agregação das moléculas de proteína. Globulinas se precipitam sob força iônica baixa Método mais comumente usado para separação de proteínas é o da adição de sais neutros (salting out)

19 Esquema explicativo da precipitação por salting-in.

20 Primeira descrição quantitativa do salting out foi feita por Cohn, em 1925:
log S =  - KS ( I ) Onde: S = solubilidade da proteína (mol/L) I = força iônica do meio (mol/L)  = constante que representa a solubilidade da proteína quando I = 0 (mol/L) KS = constante de salting out Misturas de proteínas não obedecem à equação!

21 PRECIPITAÇÃO POR SOLVENTES
A solubilidade das proteínas varia com a distribuição dos resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos na superfície da molécula; Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e outros são usados como precipitantes desde início do século XIX; Aplicação clássica: fracionamento das proteínas do plasma sanguíneo por etanol frio (Método de Cohn)

22 Principal efeito:  da constante dielétrica do meio
MECANISMO Principal efeito:  da constante dielétrica do meio Agregação de proteínas por interações eletrostáticas entre superfícies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgânico.

23 SOLVENTES Devem ser miscíveis em água, não reagir diretamente com as moléculas e ser bons precipitantes; Mais usados: metanol, etanol e acetona; Outros: n-propanol, i-propanol, 2-metoxietanol, e outros álcoois, éteres e cetonas;

24 VARIÁVEIS QUE AFETAM O PROCESSO
Temperatura: 20 – 30 ºC estimulam a xxxxxxxxxxxxxxxxxdesnaturação < 0º C pode garantir que xxxxxxxxxxxnão haja desnaturação Adição do solvente  temperatura => deve ser lenta e sob refrigeração Concentração de sais:  concentrações dificultam interações eletrostáticas => dificuldade de precipitação => % solvente pH: próximo ao pI favorece a precipitação

25 PRECIPITAÇÃO FRACIONADA
Meios a serem purificados, em geral, constituem misturas Precipitação fracionada corresponde à precipitação em duas ou mais etapas Na primeira removem-se proteínas indesejáveis menos solúveis e, nas seguintes, precipitam-se uma ou mais moléculas-alvo Em um estágio: útil como técnica de concentração Fracionada: aplicação industrial para purificação; Na precipitação fracionada em geral varia-se a concentração do agente precipitante, mas também pode-se variar outros fatores; Os estágios são chamados de “cortes” (em geral, dois);

26 30% v/v 50% v/v Representação teórica dos perfis de solubilidade de uma molécula de interesse e outras presentes no meio, em concentrações crescentes de precipitante.

27 Recuperação (%) das enzimas: xilanase (), -xilosidase () e proteínas totais ().

28 Parâmetros de Avaliação
Recuperação de proteínas totais: Rp = teor de proteínas após precipitação x 100 teor de proteínas inicial Recuperação de atividade: Ra = atividade após precipitação x 100 atividade inicial Aumento de pureza: AP = atividade específica após precipitação atividade específica inicial

29 Resultados obtidos após precipitação fracionada com etanol das enzimas xilanase, -xilosidase e proteínas totais. -xilosidase Amostra RP1 (%) RA2 AP3 Inicial - 1,0 20% etanol 71 8 0,1 60% etanol 12 74 5,9 80% etanol 18 6 0,4 Xilanase RP RA AP (AEf/AEini) 7 0,6 81 4,4 1Recuperação de proteínas totais; 2Recuperação de Atividade; 3Aumento de pureza.

30 PRECIPITAÇÃO POR POLÍMEROS
PEG (polietilenoglicol), polímero de alta massa molar, neutro e miscível em água, disponível em diversos graus de polimerização; Em geral,  proporções de polímero (15 a 30%); 4000 g/mol ou mais são os mais eficientes Mecanismo: exclusão da proteína do meio aquoso; Concentração depende do tamanho da molécula a ser precipitada e da massa molar do polímero, sendo inversamente proporcional à concentração da proteína; Remoção do polímero: ultrafiltração, diálise, adição de etanol.

31 Polieletrólitos: polímeros iônicos solúveis em água; usados devido ao baixo custo e pouca concentração residual; Policátion polietilenoimina e poliânion ácido poliacrílico Mecanismo: agregação à proteína (floculação) ou eletrostático (neutralização de cargas); PRECIPITAÇÃO PELA TEMPERATURA Mecanismo:1) diminuição: redução na solubilidade; 2) aumento: desnaturação => exposição de grupos hidrofóbicos que interagem e formam complexos insolúveis;

32 PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA
Resulta da atração eletrostática das proteínas quando estas estão próximas a seu pI; Método bastante simples: ajuste do pH Próximo ao pI a repulsão eletrostática é mínima => precipitação isoelétrica, por interação entre as zonas hidrofóbicas; Vantagem: baixo custo Desvantagem: possibilidade desnaturação Obs: Método útil para precipitar proteínas indesejáveis e otimizar outros tipos de precipitação;

33 Outros tipos de precipitação
Por afinidade: uso de interações específicas e seletivas da molécula-alvo com algum ligante; Ex.:Cibracon blue em metilmetacrilato para purificar lactato desidrogenase. Por íons metálicos: íons metálicos polivalentes podem ser usados eficientemente na precipitação: manganês, ferro, cobalto, níquel, cobre, zinco e cádmio. Mecanismo: mudanças do pI e formação de ligações cruzadas com outras proteínas.

34 Principais métodos de precipitação de proteínas
Precipitante Princípio Vantagens Desvantagens Sais neutros (salting-out) Interações hidrofóbicas pela redução da camada de hidratação da proteína - Uso universal - Baixo custo - Corrosivo - Liberação de amônia em pH alcalino Polímeros não-iônicos Exclusão da proteína da fase aquosa reduzindo a quantidade de água disponível para a solvatação da proteína - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Aumento da viscosidade Calor interações hidrofóbicas e interferência das moléculas de água nas ligações de hidrogênio, - Simples - Risco de desnaturação

35 Polieletró-litos Ligação com a molécula de proteína atuando como agente floculante - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Risco de desnaturação Precipitação isoelétrica Neutralização da carga global da proteína pela alteração do pH do meio Sais metálicos Formação de complexos Solventes orgânicos Redução da constante dielétrica do meio aumentando as interações eletrostáticas intermoleculares - Facilidade de reciclagem - Facilidade na remoção do precipitado - Risco de desnaturação de proteínas - Inflamável e explosivo