GeneXpert MTB/RIF.

Apresentação em tema: "GeneXpert MTB/RIF."— Transcrição da apresentação:

1 GeneXpert MTB/RIF

2 GeneXpert MTB/RIF teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid)
permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB) baseado na técnica de PCR em tempo real

3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Um das principais ferramentas de biologia molecular Desenvolvida por Kary Mullis em 1983, resultando no prêmio Nobel em Química

4 Importância dos oligonucleotídeos iniciadores (primers)
na síntese de DNA

5 PCR Temperatura 100 50 T e m p o Melting 94 oC 5’ 3’

6 PCR Temperatura 100 50 T e m p o Melting 94 oC 5’ 3’ 94ºC 5’ 3’

7 PCR T e m p o Temperatura Melting Melting 94 oC 94 oC Extensão
100 50 T e m p o Melting 94 oC Melting 94 oC Anelamento 50 oC Extensão 72 oC 5’ 3’ 5’ 3’ 5’

8 PCR T e m p o 30x Temperatura 94ºC 94ºC Melting 94 oC Extensão
Anelamento 50 oC Extensão 72 oC Temperatura 100 50 T e m p o 30x 5’ 3’ 94ºC 5’ 5’ 94ºC 3’ 5’

9 PCR T e m p o 30x Temperatura Melting 94 oC Extensão Anelamento 72 oC
100 50 T e m p o 30x 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 5’

10 PCR T e m p o 30x Temperatura 94ºC 94ºC Melting 94 oC Extensão
Anelamento 50 oC Extensão 72 oC Temperatura 100 50 T e m p o 30x 5’ 94ºC 5’ 5’ 94ºC 5’

11 PCR T e m p o 30x Temperatura Melting 94 oC Extensão Anelamento 72 oC
100 50 T e m p o 30x 5’ 5’

12 PCR T e m p o 30x Temperatura Fragmentos de tamanho definido Melting
94 oC Anelamento 50 oC Extensão 72 oC Temperatura 100 50 T e m p o 30x Fragmentos de tamanho definido 5’ 5’

13 Mais Ciclos = Mais DNA Número de ciclos

14 Amplificação 30 ciclos geram aproximadamente 109 moléculas
Permite aumentar a quantidade de uma determinada amostra Pode aumentar a quantidade de um contaminante

15 DNA polimerase de E. coli Klenow (derivada da DNA Pol.I de E.coli)
anelamento extensão desnaturação DESVANTAGENS: Temperatura ótima baixa e não é termoestável

16 Breve Histórico • O primeiro termociclador foi desenvolvido na Cetus Corp. – Mr Cycle • Projetado para que a DNA polimerase pudesse ser adicionada a cada ciclo

17 Yellowstone National Park

18 DNA Polimerase Termoestável
• 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC

19 • Várias enzimas isoladas desse microorganismo
incluindo a primeira DNA polimerase termoestável Taq DNA polimerase (1976)

20 Taq DNA polimerase – temperatura ótima de 72ºC e é estável até temperaturas superiores a 94ºC

21 Kary Mullis Prêmio Nobel de Química em 1993

22 Componentes de uma reação de PCR
1. Template (molde) (1–500 ng). 2. Primers (0.05–1.0 μM). 3. Mg2+ (0.5–5 mM). 4. dNTP (20–200 μM cada). 5. 1× PCR buffer 6. DNA polimerase (0.5–2.5 U para cada 50 μL de reação).

23 PCR “padrão” Permite amplificar uma determinada seqüência de DNA Clonagem gênica Sonda (northern blot, southern blot, hibridização in situ,...) Seqüênciamento (identificação de amostra, análise filogenética, confirmação de transfecção)

24 CURVA DE PCR

25 GeneXpert (Cepheid)

26

27 GeneXpert (Cepheid)

28 GeneXpert MTB/RIF

29 GeneXpert MTB/RIF

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31 Avaliação dos módulos

32 Avaliação dos módulos

33 Preparação da amostra

34 Preparação da amostra

35 Cartucho GeneXpert MTB/RIF

36 Cartucho GeneXpert MTB/RIF

37 Identificação do Cartucho GeneXpert MTB/RIF
 Manual  Automática

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41 OPÇÕES DE UTILZAÇÃO

42

43 Cancelamento de teste(s)

44 Resultado – Amostra 1

45 Resultado – Amostra 1

46 Resultado – Amostra 2

47 Resultado – Amostra 2

48 Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose
Métodos bacteriológicos Métodos Moleculares -Baciloscopia -24hs Fita Hain 3 dias ou mais (baciloscopia positiva +) -Cultivo – MGIT – 10 dias - Genexpert -2hrs - Sólido – 30 dias - Teste de Sensibilidade - MGIT -15 dias - Método das Proporções 28 a 42 dias

49 Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose
Vantagens e Desvantagens -Bacteriológico Moleculares(Genexpert) - Mais barato Mais caro (baciloscopia) - TSA Mais demorado (MGIT) Mais rápido Rif resit - Outras drogas (INH, etc.) Só para Rif - Bacilos vivos Bacilos Vivos e “mortos” - Cultivar para TSA confirmatório e outras drogas (quantidade de escarro) - Triagem - Três códons relacionados a resistência a RIF - Não detecta em amostras extra-pulmonares - Não detecata MNT