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Análises Bromatológicas
PROTEÍNAS EM ALIMENTOS Profa. Ionara F. R. Vieira
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PROTEÍNAS DEFINIÇÃO Substâncias orgânicas complexas (C, H, O, N, S, P, Fe, Cu, Zn). Polímero de alto peso molecular Unidade básica: aminoácidos IMPORTÂNCIA nutricional propriedades sensoriais
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AMINOÁCIDOS (aa) PROTEÍNAS Unidades estruturais básicas das proteínas
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AMINOÁCIDOS (AA) Cada aminoácido tem uma cadeia lateral (R) característica, que influencia suas propriedades físico-químicas. Diferenças: tamanho, estrutura e carga elétrica. Arranjo tetraédrico atividade ótica isômero L e D Só os aminoácidos L são constituintes de proteínas naturais.
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AMINOÁCIDOS (AA) Apolares ou hidrofóbicas, exemplos: leucina
alanina leucina fenilalanina valina triptofano metionina
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AMINOÁCIDOS (AA) Polares ou hidrofílicos, exemplos: tirosina
ácido aspártico serina ácido glutâmico glicina asparagina histidina
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PROTEÍNAS
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PROTEÍNAS São polímeros de aminoácidos.
Vinte tipos de aminoácidos ocorrem naturalmente nas proteínas. Diferem com o tipo, número e seqüência de aminoácidos na cadeia polimérica, conformação molecular tridimensional. Apresentam % de C, % de O, % de N, 6-8% de H, % de S.
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PROTEÍNAS ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS ESTRUTURA PRIMÁRIA
Seqüência linear de aminoácidos Nível estrutural mais importante, dele deriva todo o arranjo espacial da molécula Varia em 3 aspectos: número, seqüência e natureza dos AA
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PROTEÍNAS ESTRUTURA SECUNDÁRIA
Disposição espacial adotada pela cadeia polipeptídica Estrutura helicoidal (-hélice) – interações H intra-moleculares Estrutura foliar (folhas pregueadas) – interações H inter-moleculares
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PROTEÍNAS ESTRUTURA TERCIÁRIA
Organização tridimensional da cadeia polipeptídica contendo ou não zonas de estrutura secundária definidas Estabilização: Ligações dissulfeto (Cys + Cys = cistina) interações de hidrogênio Interações eletrostáticas Interações dipolares Interações hidrofóbicas Forças de Van der Waals Grupos hidrofóbicos dispostos no interior da molécula
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PROTEÍNAS ESTRUTURA QUATERNÁRIA
Resultado de associações não covalentes de unidades protéicas iguais ou diferentes Estas subunidades se mantém unidas por forças covalentes, como pontes dissulfeto, e ligações não covalentes, como pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas, etc.
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PROTEÍNAS NO ALIMENTO Fonte de aminoácidos na dieta e de energia.
Aminoácidos essências (lisina, triptofano, metionina, leucina, isoleucina e valina) não podem ser sintetizados pelo organismo humano. Proteínas alimentares são digeríveis, não tóxicas e palatáveis. Têm diferentes estruturas moleculares, atributos nutricionais e propriedades físico-químicas.
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PROTEÍNAS Responsáveis por compostos aromáticos e substâncias coloridas formadas por reações térmicas ou enzimáticas ocorridas durante obtenção, preparação e armazenamento dos alimentos. Componentes estruturais de muitos alimentos naturais, freqüentemente determinam sua textura, por exemplo, tenderness de produtos de carne e peixe.
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PROTEÍNAS Isoladas são usadas nos alimentos como ingredientes devidos a suas propriedades funcionais, p.e., sua capacidade de atribuir aparência, textura ou estabilidade desejáveis ao produto: agentes gelificantes, emulsionantes, espumantes e espessantes. Alergias e intolerâncias – proteínas de leite, ovos, castanhas, etc.; celíacos, fenilcetunúricos.
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MÉTODOS FISICO-QUÍMICOS DE DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM ALIMENTOS
IMPORTÂNCIA Conhecer o valor nutritivo Determinação da composição centesimal de um alimento e análise para rotulagem Estimar rendimento industrial Avaliar a qualidade (ex.: glúten qualidade da farinha) Avaliar a influência nas propriedades sensoriais
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MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO
A. Métodos que utilizam a determinação de Nitrogênio: Kjeldahl ** Dumas ** Destilação direta Métodos que utilizam técnicas nucleares: ativação por nêutrons; ativação por prótons B. Métodos químicos e físicos Reação do Biureto ** Interação proteína-corante (Dye-binding) ** Método do Reagente de Folin-Ciocalteau ou Método do fenol reagente ** Titulação com formol Espectroscopia no IV ou no UV ** Refratometria Turbidimetria ** Espectroscopia eletrônica Polarografia
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Análise de nitrogênio É a determinação mais utilizada.
Considera que as proteínas têm, em média, 16% de nitrogênio. Fator geral (F) na transformação de nitrogênio para proteínas é de 6,25%. %Proteinas = F x %N Fatores de conversão específicos: trigo- 5,70; leite- 6,38; gelatina- 5,55.
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Proteínas - Kjeldahl Desenvolvido em 1883 por Johann Kjeldahl.
Não mede proteínas diretamente. A quantidade de proteínas presentes é calculada a partir da concentração de N no alimento. Necessita de um fator de conversão (F) para converter a medida de N para proteínas. F = 6,25 (equivalente a 0,16gN/ g proteína) é usado para muitas aplicações, existem outros fatores de conversão.
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KJELDAHL É o principal método para determinação de proteínas em alimentos - é padrão e largamente usado. Tem alta precisão e boa reprodutibilidade. O método Kjeldahl é dividido em três etapas: digestão, destilação e titulação.
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CHON (alimento) (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g) (1)
Método Kjeldahl 1a etapa: Digestão O alimento é colocado no frasco de digestão e então digerido pelo aquecimento na presença de ácido sulfúrico (um agente oxidante que digere alimentos), e um catalisador (cobre, selênio, titânio ou mercúrio). A digestão converte o N do alimento (ou outro na forma de nitratos ou nitritos) em amônio, e a matéria orgânica em C02 e H20. O gás amônia não é liberado numa solução ácida porque a amônia está na forma de íon (NH4+) que se liga ao íon sulfato (SO42-) e assim permanece na solução: CHON (alimento) (NH4)2SO4 + C02(g) + H20 (g) (1)
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Método Kjeldahl (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2)
2a etapa: Neutralização e DESTILAÇÃO Depois da digestão o frasco de digestão é conectado no destilador de nitrogênio. Adiciona-se hidróxido de sódio, que converte o sulfato de amônio em gás amônia: (NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 (2) A amônia formada é liberada da solução. Por destilação por arraste a vapor a NH3 é transferida do frasco de digestão para um erlenmeyer contendo ácido bórico em excesso. NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3- (íon borato) (3)
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Erlenmeyer com solução de H3BO3
DESTILADOR Água de arraste Amostra NaOH Erlenmeyer com solução de H3BO3 DIGESTOR
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Método Kjeldahl 3a etapa: Titulação
O conteúdo de N é estimado por titulação do borato de amônio com ácido sulfúrico ou clorídrico. H2BO H+ H3BO3 (4) A concentração dos íons H+ gastos na titulação equivalem à concentração do nitrogênio. O conteúdo de N é então convertido em proteínas usando um fator apropriado: %Protein = F x %N
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Falhas do processo (Kjeldahl):
1. Não é uma medida ‘verdadeira’ de proteínas, dosa todo N - protéico e não protéico (purinas, piridinas, vitaminas, uréia, aminas, amidas, etc.). Pode melhorar a técnica precipitando a proteína e separando com lavagem (retira o N não protéico), mas, no entanto pode carregar peptídeos e aminoácidos. 3. F dá erros quando o conteúdo em N é muito diferente de 16%. Diferentes proteínas necessitam de diferentes fatores de correção pois tem diferentes seqüências de aminoácidos 5. Desvantagem: utiliza substâncias corrosivas/muito oxidantes
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DESTILAÇÃO DIRETA Modificação do método de kjeldahl. Sem digestão. Amostra + NaOH/Na2SO NH3 Mistura-se com H3BO3 e titula-se com ácido. Necessita de curva de calibração. É usado como rotina em alguns alimentos, produtos crus (no qual o tempo é mais importante que a exatidão).
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Combustão da amostra (700º-800ºC)
Método Dumas (1831) Também determina N total. Princípio: Combustão a °C – produz CO2, H2O e N2. O N2 liberado é analisado volumetricamente ou por técnica instrumental. N2 pode ser medido quando passa através de uma coluna que tem um detector de condutividade térmica no final. Combustão da amostra (700º-800ºC) Medição do N gasoso
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Equipamento - melhora precisão;
Método Dumas Necessário converter o teor de N na amostra para teor de proteínas - F. Problemas: sujeita à erros pequena qtde de amostra – amostra pode ser não representativa. Equipamento - melhora precisão; - mais rápido, uns 4-10 minutos por medida, comparado com 4-6 horas para Kjeldahl; - não necessita de reagentes ou catalisador.
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Precipitante + proteína turbidez
Turbimétrico Fundamento: medida da turbidez causada pela proteína precipitada. Agentes precipitantes: ác.tricloroacético, ferricianeto de potássio, ácido Sulfosalicílico. Precipitante + proteína turbidez Mede-se o grau de turbidez. Rápido, simples (proteínas líquidas). Desvantagens: não é usado p/sólidos; depende da proteína; depende de padrões; precipitação de interferentes.
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Métodos Espectrofotométricos
As principais diferentes entre os testes são os grupos químicos responsáveis pela absorção da radiação, exemplo: ligações peptídicas, grupos aromáticos, grupos básicos proteínas agregadas. A concentração de proteínas é determinada a partir da curva de calibração. As curvas de calibração de absorbância (ou turbidez) versus concentração proteínas é preparada usando uma série de soluções de concentração conhecida.
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Métodos espectrofotométricos UV e visível
Desvantagens: é necessário que as proteínas estejam diluídas em soluções transparentes, e que não contenham substâncias que absorvam no mesmo comprimento de onda que as proteínas. Preparação de alimentos exigem muitas etapas: homogeneização, extração por solventes, centrifugação, filtração, que podem consumir muito tempo e trabalho. Absorbância depende do tipo de proteína.
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Teste do Biureto (Riegler, 1914)
Princípio - Sais de Cu+2 em soluções alcalinas produzem cor violeta ou roxa quando interagem com ligações peptídicas. Medida feita em um Colorímetro ou espectrofotômetro. Faz-se a reação e após uns minutos lê-se a absorbância a 540 nm. Determina proteínas.
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Cor formada depende de cada proteína e a intensidade é proporcional à quantidade.
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B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
Reação das proteínas com reagente de fenol Folin-Ciocalteau e reagente de Biureto (Cu+2 em condições alcalinas). Oxidação de aminoácidos aromáticos - tirosina e triptofano - com aparecimento de uma coloração azul. Cor azul colorímetro (500 a 750 nm) curva padrão.
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B. Teste do Fenol (Follin-Ciocalteau-Lowry)
Desvantagens: É lento: operações múltiplas e período de incubação Necessita de uma curva padrão com proteína conhecida Intensidade da cor depende de cada proteína.
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C. Métodos Espectofotométricos UV
Princípio - proteínas possuem absorção UV em 280nm (aminoácidos aromáticos: tirosina, triptofano, fenilalanina. Rápido, simples, não usa reagentes e não destrutivo. Pouco exato - depende da composição dos aminoácidos. Ácidos nucléicos podem interferir.
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Corante ligado = corante inicial – corante livre.
Método Dye-binding Corantes que reagem quantitativamente com proteínas. Lisina, histidina e arginina reagem com -SO3H. Corante + proteína complexo insolúvel. Mede-se o excesso de corante colorimetricamente. A quantidade de proteína : Corante ligado = corante inicial – corante livre. Corantes: Laranja G, laranja 12, vermelho A, preto búfalo e preto amino 10B.
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Boa correlação com o Kjeldahl. Rápido, simples, exato, econômico.
DYE-BINDING Fundamento: Boa correlação com o Kjeldahl. Rápido, simples, exato, econômico. Desvantagens: Aquisição do equipamento Amostra + corante (exc.) Formação de um complexo insolúvel Separação (centrifugação ou filtração) Mede o excesso de corante que não reagiu Por diferença obtém-se a quantidade de proteína
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SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS
Solubilidade Cromatografia: - tamanho, - carga, - adsorção.
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Análise de aminoácidos
Determinar a composição de aminoácidos nas proteínas. A proteína é hidrolisada usando um ácido forte ou enzimas libera aminoácidos. Cromatografias separam os aminoácidos troca iônica, afinidade ou por absorção.
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