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Epidemiologia Molecular e Registros de Câncer Reunião da Associação Brasileira de Registros de Câncer Porto Alegre, 13-15 de maio de 2002 Sergio Koifman,

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Apresentação em tema: "Epidemiologia Molecular e Registros de Câncer Reunião da Associação Brasileira de Registros de Câncer Porto Alegre, 13-15 de maio de 2002 Sergio Koifman,"— Transcrição da apresentação:

1 Epidemiologia Molecular e Registros de Câncer Reunião da Associação Brasileira de Registros de Câncer Porto Alegre, de maio de 2002 Sergio Koifman, Escola Nacional de Saúde Pública/ Fiocruz

2 Publicações sobre risco molecular (MEDLINE) ANO n

3 Conteúdos Abordagem genético-molecular do câncer Conceituação de biomarcador molecular Genética de populações /estudo do câncer Polimorfismos genéticos no câncer Avanços tecnológicos: microarrays Desafios para os registros de câncer

4 Regulação da Proliferação Celular A proliferação celular pode ser regulada direta ou indiretamente através de etapas ou mecanismos de checagem sucessivos. Os genes que regulam este processo podem ser classificados como aqueles que: Ùproduzem fatores estimulantes a divisão celular. Ùproduzem fatores de inibição do processo.

5 Controle da Divisão Celular Existem duas rotas mutacionais envolvidas no controle da proliferação celular e na capacidade invasiva dos tumores: 1. tornar hiperativo um gene estimulador(oncogene) de carater dominante - apenas 1 das 2 copias do gene necessita estar alterada. 2. tornar inativo um gene inibidor de caráter recessivo (antioncogene): as 2 copias estão alteradas.

6 Resumo Duas categorias de genes tem um papel crítico na gênese do câncer: os inibidores tumorais e os proto-oncogenes. A perda de função dos inibidores tumorais libera as células de seus mecanismos de controle. Mutações nos proto-oncogenes estimulam as células a aumentarem de número quando não deveriam fazê-lo.

7 Resumo Mutações nos genes supressores de tumores são geralmente recessivas: não existe perda de controle até que ambas cópias do gene estejam desativadas. As pessoas que herdam 1 cópia defeituosa tem maior predisposição ao câncer. Diferentes combinações de mutações são encontradas em diferentes formas de câncer. A repetição de lesões genéticas é sugestiva de que existe um número limitado de mecanismos pelos quais o câncer é gerado.

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9 Biomarcadores Biomarkers (Nat. Research Council, 1987): indicators signaling events in biological systems or samples. Biomarcadores de exposição Biomarcadores de efeito Biomarcadores de susceptibilidade

10 Biomarcadores Marcadores de exposição: Composto exógeno no interior do organismo ou produto interativo entre o composto e um componente endógeno, ou outro evento relacionado a exposição. Ex: adduts PAH-DNA

11 Biomarcadores Marcadores de efeito: Componente endógeno ou medida da capacidade funcional ou outro indicador do estado ou balanço do organismo ou sistema orgânico afetado pela exposição. Ex. proteina p53

12 Biomarcadores Marcadores de susceptibilidade: Herdados ou induzidos, atuam como indicadores de que um indivíduo é particularmente sensível ao efeito de um xenobiótico, ou os efeitos de um grupo destas substâncias. Ex. polimorfismos enzimáticos

13 Biomarcadores de susceptibilidade - baseada no fato de que muitas substâncias químicas são alteradas por enzimas, e estas alterações podem modular a capacidade das primeiras de interagirem com o DNA ou RNA. - baseada nas diferenças genéticas quanto a capacidade das células para reparar o dano no DNA causado por agressões ambientais. - baseada em alterações genéticas pré-existentes.

14 Biomarcadores de susceptibilidade e metabolismo enzimático Os mecanismos envolvidos no processo de metabolização de xenobióticos contém dois tipos principais de enzimas: Fase I - na qual vários compostos são convertidos em metabolitos eletrofílicos reativos por enzimas de oxidação, principalmente pertencentes à família citocromo P 450 (CYPs). Fase II - enzimas de conjugação atuam usualmente como inativadoras dos metabolitos transformados na fase I ( famílias de enzimas gluthatione-S-transferase (GSTs), N-acetyl-transferase (NATs), glucuronosyltransferases, etc.

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16 Algumas alterações genéticas adquiridas são resultado de exposições ambientais (substâncias tóxicas ou carcinogênicas). A variabilidade na resposta individual frente às exposições ambientais tem sido atribuída aos polimorfismos das enzimas metabolizadoras de xenobióticos.

17 Frequência de alelos na população Gametas paternos A (p) a (q) Gametas A (p) AA (p 2 ) Aa (pq) maternos a (q) Aa (pq) aa (q 2 ) p 2 + 2pq + q 2

18 Frequência de alelos na população AA(p 2 ) Aa (2pq) aa(q 2 ) AA(p 2 ) p 4 2p 3 q p 2 q 2 Aa (2pq) 2p 3 q 4p 2 q 2 2pq 3 aa (q 2 ) p 2 q 2 2pq 3 q 4

19 Frequência de alelos na população Pares Freq AA Aa aa AA x AA p 4 p AA x Aa 4p 3 q 2p 3 q 2p 3 q - Aa x Aa 4p 2 q 2 p 2 q 2 2p 2 q 2 p 2 q 2 AA x aa 2 p 2 q 2 - 2p 2 q 2 - Aa x aa 4pq 3 - 2pq 3 2pq 3 aa x aa q q 4 total p 2 (p 2 +2pq+q 2 ) 2pq(p 2 +2pq+q 2 ) q 2 (p 2 +2pq+q 2 )

20 Equilíbrio de Hardy-Weimberg População (modelo teórico): grande tamanho (sem genetic drift) acasalamento aleatório ausência de seleção genotípica ausência de mutações ausência de migração

21 Equilíbrio de Hardy-Weimberg: aplicações Estimação da frequência de portadores Estimação da frequência de mutações Estimação das dimensões do gene

22 Glutathione S-Transferase M1 (GSTM1) and T1 (GSTT1) and Susceptibility to Oral Cavity and Larynx Cancer Hatagima 1 A; Marques 1 CFS, Rajoy 1 FS; Koifman 2 RJ; Capelli 2 JS; Kneipp 2 MB; Boffetta 3 P; Brennan 3 P; Munoz 3 N; Herrero 3 R; Koifman 2 S. Supported by : CNPq, FIOCRUZ /FAPERJ, European Community DG XII 1 Dept. Human Population Genetics, Fiocruz,Brazil 2 Dept. Epidemiology, N. School. P.Health, Fiocruz 3 Int. Agency for Research on Cancer- IARC/WHO

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24 Polimorfismos genéticos e leucemias Krajinovic et al Quebec - os genótipos GSTM1 nulo e CYP1A1*2A fatores prognósticos na LLA. Indivíduos com ambos apresentavam maior risco de desenvolverem leucemia. Meninas com CYP1A1*4 significativamente sub- representadas no grupo LLA - sugerindo papel protetor para este alelo segundo sexo.

25 Polimorfismos genéticos e leucemias Sinnett et al associação genótipo GSTM1 nulo com risco de LLA. Interação gene-gene: a presença combinada de 2 genótipos de alto risco (fenótipo acetilador lento NAT2; GSTM1 nulo; CYP1A1*2) aumenta riscos de LLA. Os três presentes conjuntamente em um mesmo indivíduo amplia mais o risco de LLA.

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29 A expressão p(A B) significa a probabilidade condicional de A dada a presença de B, sendo chamada probabilidade condicional. A expressão p(A e B) é a probabilidade conjunta, sendo a probabilidade conjunta de A e B. Num um exemplo comum na genética de câncer, p(G O) corresponde a probabilidade de ser um portador de uma mutação genética condicionado ao fato de também ser um indivíduo não afetado. TEOREMA DE BAYES

30 Determinação de estimativas da probabilidade posterior quanto à condição de portador de mutação genética para BRCA2.

31 Estimativa de probabilidade posterior quanto à condição de portador de mutação genética para BRCA2.

32 Empregam a metodologia epidemiológica no desenvolvimento, testagem e validação de biomarcadores. Empregam a metodologia epidemiológica no desenvolvimento, testagem e validação de biomarcadores. Sensibilidade e especificidade Sensibilidade e especificidade Variabilidade intra-individual Variabilidade intra-individual Variabilidade inter-individual Variabilidade inter-individual Meia-vida em tecidos selecionados Meia-vida em tecidos selecionados Valor preditivo positivo Valor preditivo positivo Factibilidade Factibilidade Relevância biológica para a doença Relevância biológica para a doença Transitional Studies

33 A área de epidemiologia molecular do câncer vem apresentando importante crescimento científico. Com o advento de tecnologias cada vez mais poderosas, grandes avanços em relação à etiologia, suscetibilidade e terapia poderão ser alcançados, com possível aplicação na área clínica. Essas conquistas poderão trazer benefícios importantes para o diagnóstico precoce, tratamento e para a qualidade de vida dos pacientes.

34 Além disso, têm um potencial considerável na determinação do risco para o câncer, identificando grupos de indivíduos com alto risco, auxiliando no estabelecimento futuro de políticas de prevenção. Uma das técnicas mais avançadas e atualmente utilizadas com grandes perspectivas de resultados é a dos micro-ordenamentos (microarrays).

35 Amostra de células 1 Amostra de células 2Isolamento do RNA Cy5 Cy3 Tintura fluorescente Mistura do cDNA e aplicação no microarray Chip de DNA Hibridização sob lamínula Leitura em microscópio DNA Microarray - princípio é o mesmo da sonda de DNA, mas em forma miniaturizada e com uma potencial de detectar fragmentos específicos muito maior, da ordem de milhares ou dezenas de milhares de sequências de DNA ou RNA sobre uma pequena lâmina de 1 a 2 cm 2.

36 A figura mostra 50 genes que distinguem melhor a Leucemia Linfóide Aguda (LLA) da Leucemia Mielóide Aguda (LMA). O painel superior mostra genes que se expressam mais na LLA e o painel inferior mostra os genes mais expressos na LMA. Cada linha corresponde a um gene e as colunas os níveis de de expressão destes genes em diferentes amostras de pacientes. Níveis maiores de expressão que a média são vermelhos e abaixo são azuis. As escalas indicam os desvios padrão acima e abaixo da média. Aitman, 2001 Ex.- Diagnóstico da Leucemia Aguda - Perfil Expressão de 6817 genes

37 Aplicações dos microarrays Perfis de expressão gênica Genotipagem Sequenciamento de DNA

38 PCR Extração do DNA de Leucócitos

39 Genotipagem do DNA O DNA genômico extraído de amostras biológicas (sangue, saliva) é amplificado por PCR e aplicado em microarray, sendo determinado o nível de expressão de milhares de biomarcadores. Apresenta grande potencial na determinação de risco, seja na pesquisa ou na prática clínica.

40 Sequenciamento do DNA O DNA extraído de amostras de sangue é amplificado e aplicado a microarrays específicos. Assim, bases de pares de DNA podem ser rastreadas para identificar mutações em genes específicos com sequencia normal já conhecida.

41 Determinação do perfil individual de expressão gênica O RNA extraído de amostras biológicas (sangue, saliva) é aplicado em microarray sendo determinado o nível de expressão individual de dezenas de milhares de genes (expressão ou assinatura gênica).

42 Registros de câncer hoje Coleta de dados clínicos Coleta de dados demográficos Coleta de dados epidemiológicos

43 Registros de câncer amanhã Coleta de dados clínicos Coleta de dados demográficos Coleta de dados epidemiológicos Planejamento e organização da coleta de amostras biológicas (sangue, saliva, amostras tumorais, etc.).

44 Parcerias interinstitucionais INCA, Universidades, Hospitais Câncer Centros de pesquisa básica (genética e biologia molecular). Centros de pesquisa clínica oncológica Centros de Anatomia Patológica Departamentos de Toxicologia Departamentos de Farmacologia

45 Atividades conjuntas Participação conjunta na identificação, coleta, processamento, armazenamento e posterior análise das amostras biológicas, a médio e longo prazo, em: estudos clinico-epidemiológicos estudos de sobrevida estudos geradores de hipóteses estudos etiológicos observacionais ensaios clínicos

46 Colaborações Científicas Sociedade Brasileira de Mutagênese, Carcinogênese e Teratogênese Ambiental Sociedade Brasileira de Genética

47 Perspectivas Ampliação da base científica atual de atuação dos registros de câncer de base hospitalar e de base populacional. Esta base será construída através do fortalecimento de uma cultura voltada para a integração e o estabelecimento de parcerias com as demais áreas envolvidas na pesquisa básica, clínica e epidemiológica do câncer no país.


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