MANIPULAÇÕES DE PROTEÍNAS, DNA E RNA.

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1 MANIPULAÇÕES DE PROTEÍNAS, DNA E RNA.
BIOLOGIA MOLECULAR CARLIZE CAMARGO, GÉDRIA ANTUNES

2 Os estudos mais detalhados sobre a célula e seus componentes, foram aperfeiçoados quando os estudiosos conseguiram confeccionar pequenas lentes de qualidade suficientemente alta para observar células e suas subestruturas. A partir daí, novos métodos para analisar proteínas, DNA e RNA estão permitindo aos cientistas estudar células e suas macromoléculas por meios nunca imaginados anteriormente. PRINCIPAIS MÉTODOS UTILIZADOS PARA ESTUDAR OS COMPONENTES MOLECULARES DAS CÉLULAS, PROTEÍNAS, DNA E RNA.

3 ISOLAMENTO E ROMPIMENTO DE CÉLULAS
ISOLAMENTO DE CÉLULAS E SEU CRESCIMENTO EM CULTURA ISOLAMENTO E ROMPIMENTO DE CÉLULAS Entender como os componentes e organelas funcionam requer uma análise bioquímica detalhada. A maioria dos procedimentos bioquímicos requer que as células sejam rompidas fisicamente para se ter acesso aos seus componentes. Essas manipulações resultam em uma população de células que podem então ser analisadas, diretamente, ou após seu número ser aumentado, pela proliferação das células em cultura.

4 CÉLULAS PODEM SER ISOLADAS A PARTIR DE TECIDOS INTACTOS
Isolamento de células Um tecido de pele, por exemplo, fornece a fonte de material celular mais real, uma vez que representam as células encontradas no corpo da maneira como realmente são, sem nenhuma alteração; Rompimento da matriz extracelular tratadas com enzimas proteolíticas (tripsina e colagenase) + EDTA (ácido etilenodiaminotetracético); O tecido então ser dissociado em células individuais por agitação leve. Matriz extracelular  une as células dos animais e que é composta de colágeno, proteoglicanos,glicoproteínas, segregadas pelas próprias células. Preenche os espaços não ocupados pelas células; onde a célula fica ancorada e assim formar os tecidos.

5 MATRIZ EXTRACELULAR

6 SEPARADOR DE CÉLULAS ATIVADO POR FLUORESCÊNCIA ELETRÔNICO.
A técnica mais comum de separação celular utiliza um anticorpo ligado a um corante fluorescente para marcar determinadas células que então podem ser separadas das não marcadas. As células deslocam-se em fileira única, em um fluxo preciso, atravessam um feixe de laser e sua fluorescência é rapidamente medida. Um tubo vibrador gera pequenas gotículas; Célula são carregadas automaticamente com uma carga positiva ou negativa; Aglomerados de células detectados pelo seu espalhamento de luz aumentado são deixados sem carga e descartados em um depósito de resíduos.

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8 MICRODISSECAÇÃO POR CAPTURA A LASER
Células selecionadas também podem ser obtidas dissecando-se cuidadosamente fatias finas de tecido que foram preparadas para serem examinadas ao microscópio. Um corte de tecido é coberto com um filme plástico fino, e a região contendo as células de interesse é irradiada com um leve foco de laser infravermelho. O laser derrete um pequeno círculo do filme, ligando as células abaixo dele. Essas células capturadas são então removidas para serem analisadas.

9 Essa técnica pode ser utilizada para separar e analisar células de diferentes áreas de um tumor, permitindo que suas propriedades ou sua composição molecular sejam comparadas com as células vizinhas normais.

10 CÉLULAS PODEM SER CULTIVADAS EM MEIO DE CULTURA
Células cultivadas em meio de cultura fornecem uma população celular mais homogênea, das quais materiais pode ser extraído facilmente. Diferentemente das bactérias, a maioria das células de tecidos não está adaptada para viver em suspensão no líquido e requer uma superfície sólida sobre a qual pode crescer e se dividir. Tais células frequentemente apresentam várias das propriedades diferenciadas apropriadas a sua origem. Ex: células derivadas de músculo esquelético embrionário fusionam para formar fibras musculares que contraem espontaneamente na placa de cultura.

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12 ALGUMAS CÉLULAS HUMANAS NÃO SÃO IMORTALIZADAS PELO TRUQUE ANTERIOR
Culturas celulares obtidas pelo rompimento de tecidos tendem a sofrer de um problema- no final as células morrem. Senescência celular replicativa- A maioria das células de vertebrados para de se dividir após um número finito de divisões celulares em cultura. Células somáticas humanas como os fibroblastos, no organismo desativaram a produção da enzima, chamada de telomerase; Mas algumas células podem ser induzidas a proliferar indefinidamente fornecendo um gene que codifica para a subunidade catalítica da telomerase; ALGUMAS CÉLULAS HUMANAS NÃO SÃO IMORTALIZADAS PELO TRUQUE ANTERIOR mecanismos de ponto de checagem que detêm o ciclo celular um processo algumas vezes chamado de "choque de cultura”. oncogenes promotores de câncer - genes que podem provocar um crescimento celular descontrolado, como aqueles derivados de vírus tumorais.

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14 CÉLULAS-TRONCO EMBRIONÁRIAS
As células-tronco de embriões têm a capacidade de se transformar, num processo também conhecido por diferenciação celular, em outros tecidos do corpo, como ossos, nervos, músculos e sangue. Se as células da placa de cultura são recolocadas em um meio embrionário inicial, elas podem dar origem a todos os tipos celulares no corpo, incluindo células germinativas Suas descendentes no embrião são capazes de se integrar perfeitamente no local que irão ocupar, adotando as características e os comportamentos que células normais teriam naquele local.

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16 Clonagem Terapêutica Clonagem Reprodutiva
O TRANSPLANTE NUCLEAR DE CÉLULASSOMÁTICAS PODE PROVER UMA MANEIRA DE GERAR CÉLULAS-TRONCO PERSONALIZADAS O termo "clonagem" tem sido utilizado de maneiras confusas como um termo geral para tipos de procedimentos bastante distintos. É importante compreender as distinções, particularmente no contexto dos debates públicos sobre a ética da pesquisa em células-tronco. Clonagem Terapêutica Clonagem Reprodutiva

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18 LINHAGENS CELULARES DE HIBRIDOMAS SÃO FÁBRICAS QUE PRODUZEM ANTICORPOS MONOCLONAIS
Anticorpos são ferramentas particularmente úteis para a biologia celular. A sua grande especificidade permite a visualização precisa de proteínas selecionadas entre as várias milhares que cada célula produz normalmente. Anticorpos são produzidos por inoculação de animais em proteínas de interesse e isolamento subsequente de anticorpos específicos para aquela proteina a partir do soro do animal. Esta tecnologia, desenvolvida em 1975, revolucionou a produção de anticorpos, permitindo sua utilização como ferramentas na biologia celular, assim como no diagnóstico e no tratamento de certas doenças, incluindo artrite reumatoide e câncer.

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21 P U R I F I CAÇÃO DE P ROTEÍNAS
A purificação de proteínas é uma série de processos que têm em vista o isolamento de um único tipo de proteínas de uma mistura complexa. A purificação de proteínas é vital para a caracterização da função, estrutura e interações da proteínas de interesse. A tecnologia do DNA recombinante (transferência de um gene de um organismo para outro) pode simplificar muito a tarefa de "enganar" as células para produzir grandes quantidades de uma proteína altamente purificada para uso clínico, tornando sua purificação muito mais fácil.

22 CÉLULAS PODEM SER SEPARADAS EM SUAS FRAÇÕES COMPONENTES
As células podem ser rompidas de várias maneiras: podem ser submetidas ao choque osmótico ou à vibração ultrassônica. Após rompidas, a suspensão de células é reduzida a um caldo grosso (chamado de homogenato, células bem trituradas) que contém uma variedade de organelas envolvidas por membranas. Os diferentes componentes do homogenato devem então ser separados, em um instrumento chamado de ultracentrifuga preparativa, que centrifuga extratos de células rompidas em altas velocidades

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24 Sedimentação por velocidade e Sedimentação por equilíbrio.

25 SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS
PROTEÍNAS PODEM SER SEPARADAS POR CROMATOGRAFIA técnica experimental utilizada para separar misturas de substâncias numa solução.

26 Existem alguns tipos de cromatografia, de acordo com sua carga (cromatografia de troca iônica), seu tamanho (cromatografia de filtração em gel) ou sua habilidade de se ligar a pequenas moléculas em particular ou a outras macromoléculas (cromatografia de afinidade).

27 ALVOS GENETICAMENTE MODIFICADOS FORNECEM UMA MANEIRA FÁCIL DE PURIFICAR PROTEÍNAS
Qualquer gene pode ser modificado para produzir sua proteína com um marcador de reconhecimento especial ligado a ele, para fazer a subsequente purificação da proteína por cromatografia de afinidade com forma simples e rápida.

28 O anticorpo pode então ser utilizado para localizar as proteínas nas células como para purificá-la.

29 ANÁLISE DE P ROTEÍNAS AS PROTEÍNAS PODEM SER SEPARADAS POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS A aplicação mais popular dessa propriedade é a eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS. Ela utiliza um gel de poliacrilamida (é um polímero utilizados para fabricação de géis para eletroforese) de ligações altamente cruzadas como uma matriz inerte, pela qual as proteínas migram. As proteínas estão em uma solução que inclui um detergente fortemente carregado negativamente, dodecil sulfato de sódio – SDS. Como esse detergente se liga a regiões hidrofóbicas das moléculas proteicas, causando o seu desdobramento em cadeias polipeptídicas estendidas.

30 Quebrar quaisquer ligações S-S (ligações dissulfeto) nas proteínas.

31 PROTEÍNAS ESPECÍFICAS PODEM SER DETECTADAS POR BLOTTING COM ANTICORPOS
Após o seu fracionamento na técnica anterior, todas as proteínas presentes no gel são expostas a um anticorpo específico, que tenha sido ligado a uma enzima facilmente detectável ou a um corante fluorescente. Esse procedimento normalmente é realizado depois de todas as proteínas separadas presentes no gel terem sido transferidas (por blotting) para uma folha de papel de nitrocelulose ou membrana de náilon. A membrana é então colocada em uma solução com o anticorpo marcado para revelar a proteína de interesse. Esse método de detecção de proteínas é chamado de Westem blotting.

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33 A ESPECTROMETRIA DE MASSAS FORNECE UM MÉTODO ALTAMENTE SENSÍVEL PARA IDENTIFICAR PROTEÍNAS DESCONHECIDAS. Espectrometria de massas (ferramenta física que caracteriza as moléculas pela medida da relação massa/carga de seus íons) A forma mais comum utilizada da técnica é chamada de ionização/dessorção de matriz assistida por laser - espectrometria por tempo de voo MALDI-TOF. As proteínas na amostra são primeiro quebradas em peptídeos curtos. Esses peptídeos são misturados com um ácido orgânico e então secados sobre uma lâmina de metal ou cerâmica. Um laser então atinge a amostra e ioniza os peptídeos. Os peptídeos ionizados são acelerados em um campo elétrico e voam em direção ao detector. Pela análise desses peptídeos ionizados que chegam ao detector, as massas precisas dos peptídeos podem ser determinadas.

34 Empregando-se o uso de dois espectrômetros de massas alinhados (um arranjo conhecido como MS/MS) é possível determinar diretamente as sequências de aminoácidos de peptídeos individuais em uma mistura complexa MS/MS é particularmente útil para detectar e mapear com precisão modificações pós-traducionais de proteínas.

35 MEDIDAS HIDRODINÂMICAS REVELAM O TAMANHO E A FORMA DE UM
COMPLEXO PROTEICO A maioria das proteínas em uma célula atua como parte de complexos maiores, e o conhecimento do tamanho e da forma desses complexos muitas vezes leva a pistas a respeito da sua função. A massa molecular também pode ser determinada mais diretamente utilizando-se uma ultracentrífuga analítica, um aparelho complexo que permite que medidas da absorbância proteica de uma amostra sejam realizadas enquanto ela é submetida a forças centrífugas.

36 GRUPOS DE PROTEÍNAS QUE INTERAGEM PODEM SER IDENTIFICADOS POR MÉTODOS BIOQUÍMICOS
Como a maioria das proteínas na célula funciona como parte de complexos com outras proteínas, uma importante maneira para começar a caracterizar o papel biológico de uma proteína desconhecida é identificar todas as outras proteínas com as quais ela se liga especificamente.

37 AS INTERAÇÕES ENTRE PROTEÍNAS TAMBÉM PODEM SER IDENTIFICADAS POR UMA TÉCNICA DE DOIS HÍBRIDOS EM LEVEDURAS Até o momento, enfatizamos abordagens bioquímicas para estudar as interações entre proteínas. Entretanto, uma estratégia particularmente potente, chamada de sistema de dois híbridos, explora os mecanismos das próprias células para revelar as interações entre proteínas.

38 Quando essa construção é introduzida em levedura, as células produzem a proteína de fusão, com a proteína-alvo ligada a esse domínio de ligação ao DNA.

39 DADOS COMBINADOS DERIVADOS DE DIFERENTES TÉCNICAS PRODUZEM MAPAS CONFIÁVEIS DE INTERAÇÕES ENTRE PROTEÍNAS Mapas extensivos de interações entre proteínas podem ser muito úteis para identificar as funções das proteínas por essa razão, tanto o método de dois híbridos como a técnica bioquímica foram automatizados para determinar as interações entre milhares de proteínas.

40 MÉTODOS ÓPTICOS PODEM MONITORAR AS INTERAÇÕES ENTRE PROTEÍNAS EM TEMPO REAL
Um método particularmente útil para monitorar a dinâmica da ligação de uma proteína com outras moléculas é chamado de ressonância plasmônica de superfície SPR. O método SPR tem sido utilizado para caracterizar uma ampla variedade de interações moleculares, ínc1uíndo a ligação entre anticorpo e antígeno, a ligação de proteínas ao DNA, carboidratos, pequenas moléculas e outras proteínas.

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42 Outro método óptico utiliza a proteína fluorescente verde (GFP).
Essa técnica é especialmente potente, pois, quando combinada à microscopia de fluorescência, ela pode ser utilizada para caracterizar interações entre proteínas em locais específicos dentro das células vivas. Nessa aplicação, duas proteínas de interesse são marcadas com diferentes fluorocromos, de modo que o espectro de emissão de um fluorocromo sobrepõe o espectro de absorção do segundo fluorocromo. A transferência de energia, chamada de transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET), é determinada iluminando-se o primeiro fluorocromo e medindo-se a emissão do segundo

43 (A) proteina X é acoplada a uma proteína fluorescente azul, que é excitada por luz violeta e emite luz azul. A proteína Y é acoplada a uma proteína fluorescente verde, que é excitada por luz azul e emite luz verde. (B) Se as proteínas X e Y não interagirem, a incidência de luz violeta na amostra gera fluorescência apenas a partir da proteína fluorescente azul. (C) Quando as proteínas X e Y interagem, FRET pode ocorrer. A incidência de luz violeta na amostra excita a proteína fluorescente azul, cuja emissão por sua vez excita a proteína fluorescente verde, resultando na emissão de luz verde.

44 cristalografia por raios X.
A ESTRUTURA PROTEICA PODE SER DETERMINADA PELO USO DE DIFRAÇÃO DE RAIOS X cristalografia por raios X.

45 A NMR PODE SER UTILIZADA PARA DETERMINAR A ESTRUTURA DE PROTEÍNAS
EM SOLUÇÃO Espectroscopia de ressonância magnética nuclear NMR- foi muito utilizada por vários anos para analisar a estrutura de pequenas moléculas Um pequeno volume de solução proteica concentrada que é colocado em um campo magnético forte; que irá detalhar a estrutura tridimensional de moléculas em solução.

46 Ex: A RMN em alta resolução tem sido utilizada para determinar as origens geográficas e autentificar sucos de frutas, estudar as trocas bioquímicas em frutas e em seu suco, investigar a variabilidade dos compostos presentes em uvas, quantificar componentes químicos em sucos, entre outros.

47 A SEQUÊNCIA DA PROTEÍNA E SUA ESTRUTURA FORNECEM PISTAS SOBRE A
FUNÇÃO PROTEICA Como as proteínas com estruturas similares frequentemente têm funções semelhantes, a atividade bioquímica de uma proteína muitas vezes pode ser predita pesquisando-se em bancos de dados proteínas já caracterizadas que são similares em suas sequências de aminoácidos.

48 REFERÊCIAS: BRUCE, Alberts. et al ; Biologia molecular da célula. 5. ed. Porto Alegre. Artrned, 2010.

49 OBRIGADA!!!!!