Projeto de Doutorado Direto e Resultados Parciais

Apresentação em tema: "Projeto de Doutorado Direto e Resultados Parciais"— Transcrição da apresentação:

1 Projeto de Doutorado Direto e Resultados Parciais
Identificação e Mapeamento de Genes Associados a Mecanismos de Fitopatogenicidade de Crinipellis perniciosa Através da Obtenção de ESTs Projeto de Doutorado Direto e Resultados Parciais Orientador: Gonçalo A. G. Pereira Co-orientador: Lyndel W. Meinhardt Doutoranda: Johana Rincones

2 Introdução A Vassoura-de-Bruxa:
Grande importância econômica para o Brasil (15% a 4% em 10 anos) Crinipellis perniciosa Basidiomiceto, Agaricales, Tricholomataceae Ciclo de vida hemibiotrófico Projeto Genoma Bla bla bla bla

3 Introdução Por que ESTs (Expressed sequence tags)?
cDNA: seqüências codantes livres de introns cDNAs podem ser seqüenciados completos ou como ESTs gerando 300 a 500 bp ou ~100 aa para busca por similaridade Complementam o seqüenciamento genômico: Nível de complexidade de um tecido Influência de fatores ambientais sobre a expressão do tecido Úteis no mapeamento físico Identificação de introns e exons Estudo evolutivo de genes e clonagem

4 Introdução Bases de dados no GeneBank e COGEME possuem seqüências de ESTs para mais de 20 fungos, alguns dos quais são fitopatogênicos A análise por similaridade dos ESTs de C. perniciosa permitiria estabelecer a função putativa de ~40% dos genes Alinhamentos entre os ESTs e a seqüência genômica permitiriam identificar introns, exons e seqüências regulatórias Mapeamento físico, identificação de genes alvo para drogas ou inativação com sondas antisense, sondas para microarrays

5 Justificativa Um dos primeiros em analisar cDNAs associados à fitopatogenicidade de um fungo geneticamente complexo e com o genoma em andamento O estudo da expressão gênica do fungo durante a interação com o hospedeiro facilitaria a compreensão da doença e os mecanismos gerais de fitopatogenicidade Microarrays não fornecem informações sobre seqüência, tamanho e localização dos cDNAs Complementa o mapeamento proposto no projeto de mestrado

6 Projeto de Mestrado “Mapeamento físico do genoma de C. perniciosa”: Estabelecimento do cariótipo molecular por PFGE Seleção de clones de DNA genômico para localização cromossômica (Contigs, funcionais) Arranjo destes clones em membranas de nylon Eluição das bandas cromossômicas a partir dos géis de PFGE e marcação radioativa Hibridização Southern para estabelecer a localização cromossômica dos clones selecionados Anotação dos genes e agrupação dos contigs por cromossomo  

7 Objetivos Ampliar o mapa físico do projeto de mestrado com informações referentes a: Expressão gênica: identificação de genes de fitopatogenicidade Estrutura destes genes: introns, exons, seqüências regulatórias Mediante a construção de biblioteca subtraída de cDNA e seqüenciamento de ESTs Localização cromossômica por hibridização Clonagem e seqüenciamento de transcritos completos a partir de bibliotecas não subtraídas

8 Materias e Métodos Linhagem: CP02 (Genoma) com 8 cromossomos de 2,9 a 5,9 Mb e um tamanho total de ~30 Mb Extração de RNA total em presença e ausência de extrato de cacau Obtenção de mRNA Síntese de cDNA: “Hibridização Subtrativa por Supressão” e construção de bibliotecas full-length Clonagem e seqüenciamento de ~5000 ESTs Análise das seqüências e seleção de 96 clones para mapeamento e 96 clones para obtenção de seqüência completa (full-length cDNA)

9 RNA Total  Extração de RNA total:
Meio sintético (6 g/L KNO3, 0,52 g/L KCl, 0.52 g/L MgSO4, 1,52 g/L KH2PO4, traços FeSO4 e ZnSO4 e pH 6,8) contendo 10 g/L Glicose (Driver) ou 10 g/L Cacau (Tester) 5 períodos de crescimento: 3 curtos (24h, 48h e 72h) e 2 longos (6 dias e 8 dias) Micélio macerado em nitrogênio líquido, extraído com TRIzol e PVP-40 e precipitado em isopropanol e citrato de sódio: Polisacarídeos!

10 RNA Total Os RNAs dos 5 períodos de crescimento para cada amostra (Tester e Driver) foram misturados e purificados em coluna Qiagen Cacau Glicose 24h 48h 72h 6d 8d 24h 48h 72h 6d 8d

11 mRNA e cDNA Extração de mRNA
Com oligo dT biotinilado e partículas paramagnéticas com estreptavidina (Promega). Amostras concentradas em SpeedVac para obter ~1ug/uL. cDNA obtido por extensão de primer polyT e transcriptase reversa (primeira fita) e com T4 DNA polimerase (segunda fita) (Clontech) bp 1353— 1- phiX174/Hae III 2- cDNA a partir de mRNA de placenta humana (Kit) 3- cDNA a partir de mRNA de Cp extraído em Glicose (Driver)

12 mRNA e cDNA Amplificação do mRNA e síntesis de cDNA por LD-PCR (SMART- Clontech) 5’ PolyA 3’ mRNA Primer dT modificado 5’ Primer SMART GGG TR 5’ PolyA 3’ GGG CCC Degradação RNA CCC 5’ 3’ cDNA fita simples Primer PCR LD-PCR CCC 3’ 5’ cDNA dupla fita amplificado GGG 3’ 5’

13 mRNA e cDNA Glicose Cacau
1 Kb 2500 bp ---- 2000 bp 1500 bp---- 1000 bp---- 500 bp---- Glicose Cacau A padronização resultou num número ótimo de 18 ciclos para a amostra crescida em Glicose e 21 ciclos para a amostra crescida em Cacau

14 mRNA e cDNA 1Kb M G18 C21 3000 bp---- 2500 bp---- 2000 bp---- 1500 bp---- 1353 bp 1078 bp 872 bp 603 bp 310 bp 281 bp 271 bp 234 bp 194 bp Após a padronização, a reação foi repetida num volume final de 100 uL e utilizando o número otimizado de ciclos para cada amostra. Estes cDNA de dupla fita serão utilizados para a construção de bibliotecas de cDNA full-length utilizando a metodologia SMART (Clontech)

15 mRNA e cDNA LD-PCR para biblioteca subtrativa (Primers SuperSMART)
Hae P18 G18 C21 bp 1353-- 603--- 310--- G21 G24 C24 C27 ~2000 ~700 Primers sintetizados por Imprint funcionaram Número ótimo de 19 ciclos para Glicose e 26 ciclos para Cacau A reação foi repetida num volume total de 200 uL para hibridização subtrativa

16 Bibliotecas Full-length
O cDNA amplificado por LD-PCR foi purificado e digerido com Sfi I para eliminação dos primers e criação das bordas cohesivas necessárias para a clonagem direcionada no plasmídio pDNR-Lib (Clontech) 1 – Glicose após LD-PCR (18 ciclos) 2 – Glicose após purificação (GFX, Amersham) 3 – Glicose após digestão com Sfi I 4 – Cacau após LD-PCR (21 ciclos) 5 – Cacau após purificação 6 – Cacau após digestão com Sfi I M

17 Bibliotecas Full-length
Os produtos da digestão foram fracionados por tamanho para evitar a presência de fragmentos pequenos que clonan preferencialmente M G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G M M C1 C2 C3 C4 C5 C6 M C7 C8 C Foram coletadas as frações 6, 7, 8 e 9 de cada amostra e precipitadas em presência de glicogênio overnight Os cDNA de cada amostra foram ligados no plasmídeo pDNR-Lib (Clontech) e transformados em células eletrocompetentes de E. coli DH5a 

18 Hibridização Subtrativa
Hibridização Subtrativa por Supressão (PCR-Select, Clontech) cDNA Tester e Driver Digestão com Rsa I (GTAC) Tester dividido em duas populações, cada com um adaptador diferente Hibridização normaliza e enriquece com seqüências presentes unicamente no Tester Moldes para PCR são gerados a partir de seqüências diferenciais PCR de Supressão

19 Hibridização Subtrativa
Digestão com Rsa I MM bp 1353- 603-- 310-- MM 1 – Driver após LD-PCR (19 ciclos) 2 – Driver após purificação 3 – Driver após digestão com Rsa I 4 – Tester após LD-PCR (26 ciclos) 5 – Tester após purificação 6 – Tester após digestão com Rsa I 1 – Driver após digestão 2 – Driver após purificação 3 – Driver após precipitação 4 – Tester após digestão 5 – Tester após purificação 6 – Tester após precipitação

20 Hibridização Subtrativa
Ligação dos adaptadores e hibridização Tester com Adaptador 1 Driver Tester com Adaptador 2 Primeira hibridização 6-8 horas Segunda hibridização: mistura as amostras em presência de mais driver

21 Hibridização Subtrativa
PCR de Supressão Não amplifica Amplificação linear PCR com primers dos adaptadores Preenche as bordas Amplificação Exponencial

22 Hibridização Subtrativa
Teste de eficiencia da ligação dos adaptadores M M 1 – T/Adap1 FN For e PCR Primer 2 – T/Adap1 FN For e FN Rev 3 – T/Adap2 FN For e PCR Primer 4 – T/Adap2 FN For e FN Rev 5 – Full-length cDNA Primer FN For e FN Rev 1 – T/Adap1 FN For e Nest Primer 1 2 – Idem 3 – T/Adap2 FN For e Nest Primer 2 4 – Idem 5 – Idem 6 – Full-length cDNA e PCR Primer

23 Hibridização Subtrativa
PCR de Supressão M 1 – PCR primária (primer PCR) da subtração 2 – PCR primária do controle não subtraído 3 – PCR primária do controle do kit 4 – PCR secundária (Primers nested 1 e 2) da subtração 5 – PCR secundária do controle não subtraído 6 – PCR secundária do controle do kit

24 Hibridização Subtrativa
Clonagem em vetor TA: A PCR secundária foi repetida utilizando 10 ciclos ao invés de 15 e os produtos de PCR foram ligados no vetor TOPO TA (Invitrogen) segundo instruções do fabricante Células elotrocompetentes de E. coli DH5a foram transformadas com o vetor por eletroporação As bactérias não cresceram... 

25 Próximas Etapas Verificar a eficiência da subtração com ensaios de hibridização Validar as bibliotecas por seqüenciamento: Raquel Análise das seqüências: Bioinfo Seleção dos clones para mapeamento Eluir as bandas cromossômica de géis de pulsed-field: Gabriel Mapeamento dos clones Seleção de clones para obtenção de transcritos completos Screening das bibliotecas full-length