Métodos Alternativos para Enumeração e Identificação de Microrganismos

Apresentação em tema: "Métodos Alternativos para Enumeração e Identificação de Microrganismos"— Transcrição da apresentação:

1 Métodos Alternativos para Enumeração e Identificação de Microrganismos
QUESTÕES DE PROVAS; CONTEÚDO DAS PRÓXIMAS AULAS; EXERCÍCIOS CONCEITUAIS; Blog do professor:

2 Histórico A tarefa do laboratório de microbiologia na área farmacêutica consiste em prover, para todo o processo de produção, informações de natureza microbiológica, tais como: TESTES DO PRODUTO TERMINADO MONITORAÇÃO AMBIENTAL TESTES DE CONTROLE NO PROCESSO

3 Histórico Para este propósito, o microbiologista deve dispor de métodos analíticos confiáveis e exatos, que permitam a enumeração e identificação de microrganismos; Falhas neste aspecto conduzirão a sistemas fora de controle, ocasionando como consequência a possibilidade de uso, pelo paciente, de produto potencialmente inseguro, além de perdas para a empresa;

4 Histórico A área de métodos rápidos e automação têm se desenvolvido aceleradamente nos últimos 15 a 20 anos; Disponibilizando tecnologia e instrumentos levando-se em conta o ambiente da indústria farmacêutica, que é altamente regulado; Assim, observa-se uma abordagem conservadora e que apresenta a necessidade de rígidos requisitos de validação;

5 Histórico A maioria dos testes efetuados hoje continua a ter por base métodos seculares, desenvolvidos pelos microbiologistas pioneiros; a.c. Louis Pasteur Robert Koch Joseph Lister

6 Histórico Testes baseados na diluição seriada e recuperar os microrganismos usando meio de cultura estéril, sólido ou líquido; Isto ocorre porque esses métodos são simples e não dispendiosos, podem ser muito eficientes, e têm uma longa história de aplicação; Porém, existem limitações decorrentes da baixa velocidade do crescimento microbiano, seleção do meio de cultura e respostas heterogêneas;

7 Histórico Assim, verificou-se a necessidade da criação de uma força tarefa, que trabalhando conjuntamente para implementar os novos testes publicou um relatório designado PDA Technical Report nº 33, Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing Methods (PDA, 2000); O relatório influenciou na publicação de diversos outros capítulos e, como resultado, os métodos microbiológicos rápidos passaram a ser vistos e considerados para implementação na indústria;

8 Histórico É necessário avaliar, validar e obter aprovação na implementação das novas técnicas; Então surge a questão se os novos métodos são tão bons quanto os métodos clássicos ou convencionais.

9 Novos paradigmas De 1965 a 1975 enfatizou-se a miniaturização e o desenvolvimento de kits diagnósticos; O período do desenvolvimento de kits de testes imunológicos ocorreu de 1975 a 1985, enquanto de 1985 a 1995 o foco recaiu sobre as provas genéticas e a reação de polimerase (polymerase chain reaction – PCR); A tendência atual tem, de modo geral, se dirigido ao âmbito do biosensor e da tecnologia do chip, contando com instrumentação e automação;

10 Novos paradigmas Porém, a maioria dos métodos disponibilizados aos microbiologistas farmacêuticos e aceitos pelas autoridades regulatórias, baseiam-se em métodos de cultivo;

11 Novos paradigmas Considerando os vários dias de incubação, e o impacto dessa demora levar à perda de produtos contaminados; Por exemplo, se for identificada contaminação num teste em processo, um ciclo de fabricação pode ser interrompido e o problema corrigido; Assim, podendo ser poupado o alto custo do produto terminado e dos inventários e evitando a redução da flexibilidade de resposta à demanda;

12 Novos paradigmas Outra desvantagem relativa à abordagem usual ou tradicional consiste no fato de que métodos de cultivo empregados podem não ser capazes de recuperar todos os microrganismos presentes na amostra-teste; O que pode resultar na potencial liberação de produto contaminado; Novas tecnologias microbiológicas, que superam todas ou algumas das limitações dos métodos convencionais, estão disponíveis;

13 Novos paradigmas Estes novos métodos apresentam resultados no mesmo dia ou em até 2 dias, muito mais rápido quando comparado aos métodos tradicionais; Existem certos sistemas cujos resultados podem ser obtidos em tempo real, tornando possível obter monitoramento ambiental ou biocarga de insumos antes do início da produção; Adicionalmente, há métodos rápidos que não dependem de cultivo, assim, não exigem o crescimento de microrganismos;

14 Métodos Microbiológicos
Os métodos de testes microbiológicos podem ser divididos em três amplas categorias gerais, de acordo com a sua finalidade: Detecção de presença ou de ausência de microrganismos em uma amostra-teste; Enumeração de microrganismos presentes na amostra-teste; Caracterizar e identificar microrganismos que são recuperados de produto ou do ambiente;

15 Métodos Microbiológicos
Considerando as tecnologias para testes de controle de qualidade microbiológico, com ênfase nas inovadoras, podemos classificá-las em: Tecnologias baseadas no crescimento; Tecnologias baseadas na viabilidade; Tecnologias baseadas nos componentes celulares, ou artefatos; Tecnologias baseadas nos ácidos nucleicos;

16 Tecnologias Baseadas no Crescimento
Parâmetros bioquímicos ou fisiológicos refletem o crescimento dos microrganismos e, sendo dependentes do crescimento destes, não são caracterizados como testes realmente rápidos; Adicionalmente, a seletividade inerente de meios de cultura e suas condições de incubação limitam a faixa de microrganismos a serem enumerados; As tecnologias baseadas no crescimento e suas aplicações incluem:

17 Tecnologias Baseadas no Crescimento Bioluminescência ATP e AK

18 Tecnologias Baseadas no Crescimento
A medida de bioluminescência do ATP para análise microbiológica é amplamente usada na indústria de alimentos e cosméticos, para várias aplicações, incluindo monitoramento e testes de produtos terminados; Nos últimos anos tem crescido o interesse dos laboratórios farmacêuticos por estes sistemas; Comercialmente disponíveis, há três sistemas com potencial uso na indústria farmacêutica:

19 Tecnologias Baseadas no Crescimento
MicroStar® PallChek® Rapidscreen®

20 Tecnologias Baseadas no Crescimento
Detecção colorimétrica e da pressão do headspace de produção de CO2

21 Tecnologias Baseadas no Crescimento
GLICOSE e LACTOSE MANITOL Utilização de carbono, reações bioquímicas e fisiológicas

22 Tecnologias Baseadas no Crescimento
Impedância e condutividade (detecção de bioburden)

23 Tecnologias Baseadas no Crescimento
Permite a automatização na semeadura de amostras, evitando contaminações cruzadas e diminuindo o tempo e o número de placas; Plaqueamento Espiral

24 Tecnologias Baseadas no Crescimento
Membrana filtrante hidrofóbica Pour plate e semeadura da amostra em superficie

25 Tecnologias Baseadas no Crescimento Método dos tubos múltiplos

26 Tecnologias Baseadas na Viabilidade
Baseiam-se na coloração vital de componentes bioquímicos das células microbianas, ou ainda na fluorescência da clivagem enzimática de substratos fluorogênicos das paredes celulares; Como não se baseiam no crescimento dos microrganismos, podem ser universais e rápidos; Microscopia direta de filtro epifluorescente Suas aplicações incluem:

27 Tecnologias Baseadas na Viabilidade
Citometria de Fluxo

28 Tecnologias Baseadas em Componentes Celulares ou Artefatos
Baseiam-se na medida de componentes celulares que proporcionam um alto grau de especificidade conduzindo a resultados rápidos; As desvantagens incluem a possível necessidade de elevado número de células para alguns tipos de testes, sua alta especificidade, necessidade de grandes bases de dados e mudança de paradigma, ao tratar microrganismos (entidades bioquímicas) como substâncias químicas;

29 Tecnologias Baseadas em Componentes Celulares ou Artefatos
Suas aplicações incluem: Perfis de ésteres metílicos de ácidos graxos; Espectrometria de massa por dessorção e ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF); Técnicas de fluorescência de anticorpos; Ensaio de imunossorbância ligada à enzima;

30 Tecnologias Baseadas em Componentes Celulares ou Artefatos
Suas aplicações incluem: Aglutinação de látex; Ensaio de endotoxina; Coloração de Gram;

31 Tecnologias Baseadas nos Ácidos Nucleicos
Baseiam-se na detecção de sequências de ácidos nucleicos. São limitadas pela preparação de amostra, captura do alvo, amplificação e detecção das sequências de ácidos nucleicos; Suas aplicações incluem: Sondas de ácidos nucleicos; Amplificação de DNA - PCR;

32 Tecnologias Baseadas nos Ácidos Nucleicos
Técnicas de sequenciamento do RNAr, porções 16S e 23S; Impressões digitais (fingerprint) – PCR – baseadas na sequência repetitiva; Amplificação da transcrição – mediada em tempo real; Pyrosequencing;

33 Tecnologias Baseadas nos Ácidos Nucleicos
Riboprinting automatizado; Mapeamento óptico;

34 OBRIGADO