Fundamentos de ENGENHARIA GENÉTICA

Ácidos Nucleicos James Watson e Francis Crick Em 1953 Watson e Crick apresentaram o modelo de dupla hélice para a molécula de DNA – duas cadeias polinucleotídicas antiparalelas.

Engenharia Genética Durante 25 anos, desde 1950 a 1975, a molécula de DNA foi considerada “ intocável”. A partir da década de 70, a Ciência e a Tecnologia a trabalhar em conjunto, têm fornecido importantes conhecimentos sobre a vida, desde a altura que começaram a manipular o DNA.

Engenharia Genética A partir da década de 70 do séc. XX foi desenvolvido um vasto conjunto de técnicas de análise e manipulação do DNA, com implicações éticas e sociais. A Engenharia Genética baseia-se num conjunto de técnicas e ferramentas que permite a intervenção no genoma de um organismo construindo novos genomas por recombinação de segmentos genómicos de um mesmo ou de diferentes cromossomas.

Vírus - Bacteriófago

Vírus atacar a Bactéria

Enzimas de Restrição

Enzimas de Restrição Escherichia coli (Bactéria) 5´ 3´ 5´ 3´

Enzimas de restrição/ Ligases do DNA As enzimas de restrição fragmentam o DNA por hidrólise em locais específicos. A especificidade é dada pela sequência de nucleótidos que a enzima reconhece, fragmentando o DNA sempre que encontra essa sequência. Formam-se fragmentos de DNA, em hélice dupla, mas com uma pequena extensão em cadeia simples em cada extremidade. As extremidades (coesivas ) podem ligar-se, por complementariedade a outro DNA, com intervenção de outras enzimas – ligases do DNA.

Enzimas de restrição e DNA ligase Organismo A Organismo B Os dois DNA estão ligados

Vectores As enzimas de restrição e as ligases do DNA são ferramentas da engenharia genética que permitem manipular e transferir genes de uma molécula de DNA para outra, isto é, de um organismo para outro. Na transferência de genes é necessária a existência de um “transportador”, isto é, um vector que leva o material genético de um genoma para outro. Há diversos tipos de vectores sendo os plasmídeos das bactérias dos mais utilizados.

Plasmídeos Muitas bactérias possuem, para além da molécula de DNA principal, pequenas moléculas de DNA em cadeia dupla – os plasmídeos. Geralmente, os genes dos plasmídeos não são essenciais à sobrevivência da bactéria, podendo ser retirados. Podem replicar-se independentemente da molécula de DNA principal, podendo fundir-se com ela.

Plasmídeos

Técnica do DNA recombinante 1.- “Abertura” da molécula de DNA do plasmídeo, num ponto específico, pela enzima de restrição; 2.- Isolamento de genes de interesse noutras moléculas de DNA “dadoras “ recorrendo a enzimas de restrição do mesmo tipo; 3.- Junção do gene a inserir. Do plasmídeo e de ligases do DNA; 4.- Ligação do gene ao plasmídeo formando-se o DNA recombinante; 5.- Introdução do plasmídeo recombinante em bactérias, que funcionam como células hospedeiras do novo gene; 6.- Produção da proteína desejada a partir do DNA recombinante.

DNA recombinante

DNA recombinante

Técnica do DNA recombinante

DNA recombinante ou rDNA A técnica do DNA recombinante permite produzir moléculas de DNA a partir da combinação de genes com proveniências diferentes. É possível introduzir um gene humano em bactérias para que estas produzam, em larga escala, uma determinada proteína humana. Além disso, o gene com interesse é clonado permitindo a sua conservação em diversas cópias para posteriores utilizações – bibliotecas de genes.

Biblioteca de genes

DNA recombinante- Aplicações

DNA complementar mRNA Enzima que existe em alguns Vírus DNA polimerase

DNA complementar ou cDNA Este DNA é obtido a partir do mRNA por complementaridade de bases, um mRNA que já sofreu processamento ( não contém intrões ) . A produção de cDNA é possível por ação da enzima transcriptase reversa. O mRNA funciona como molde para a síntese de uma cadeia de DNA, um processo inverso do que se passa habitualmente na transcrição. Após a formação da primeira cadeia de cDNA , a DNA polimerase forma a cadeia complementar, constituindo-se uma molécula estável.

DNA complementar - Técnica

DNA complementar ou cDNA A comparação entre o cDNA (sem intrões) e o DNA original permite localizar as regiões codificantes (exões) e as não codificantes (intrões ) de um determinado gene. O cDNA facilita a produção de proteínas de seres eucariontes em bactérias uma vez que estas não possuem mecanismos de processamento do mRNA, isto é, em presença de um DNA original transcreveriam todo o gene, incluindo os intrões, obtendo-se proteínas diferentes das que queríamos. Ao ser inserido um clone de cDNA garante-se a produção de proteínas normais.

Reacção de polimerização em cadeia (PCR) É uma das técnicas para clonar DNA de modo a obter grandes quantidades a partir de uma pequena amostra.

PCR - Fases 1º-Aquecimento do DNA para separar as duas cadeias ; 2º- Adição de nucleótidos e da enzima DNA polimerase para que a dupla hélice seja reconstruída a partir de cada uma das cadeias simples; 3º- Repetição do procedimento de modo a produzir cópias suficientes do DNA em estudo.

DNA fingerprint

Impressões digitais genéticas Cada indivíduo possui o seu próprio DNA, que é único. No seio do DNA encontram-se zonas de restrição, sequências repetitivas ao longo da molécula, cujo número, tamanho e localização são variáveis de indivíduo para indivíduo. Submetido à ação das enzimas de restrição o DNA fragmenta-se em porções de diferentes tamanhos e pesos moleculares. Estes pedaços de DNA, sujeitos a electroforese, revelam um padrão de fragmentos de restrição que é único para cada indivíduo, funcionando como um “código de barras “ genético.

DNA fingerprint – aplicação forense

DNA fingerprint – testes de paternidade