EXTRAÇÃO DE ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO CÉLULAS VEGETAIS E ANIMAIS

Células Vegetais

BANANA Nome científico: Musa spp. Família: Musaceae Nomes populares: Banana Origem: provavelmente Ásia  MORANGO Nome científico:  Fragaria vesca Família: Rosaceae Nome Popular: Morango, morangueiro, morango- silvestre, morangueiro-bravo, fragária, frutilha Origem: Europa e Américas

Material Experimental Banana / Morango Saco plástico Detergente Sal Vidraria transparente (cálice, Becker, Enlermeyer ou equivalente) Bastão de vidro Álcool gelado Água morna Coador ou filtro Faca / colher

Procedimento experimental Colocar o material em um saco plástico e macerá-lo com as mãos. Após verificar que o material está bem macerado, acrescentar à mistura: 02 colheres de detergente, 01 pitada de sal e 25ml de água morna Misturar o material no próprio saco plástico, por 5 minutos. Filtrar/coar o material em um frasco. Acrescentar ao filtrado, álcool etílico gelado, delicadamente sobre as bordas do frasco. Observar o DNA se precipitando sobre a superfície do material biológico.

CÉLULAS ANIMAIS

EQUIPAMENTOS E Materiais UTILIZADOS: - Raspado de mucosa bucal. - Swab. - Recipiente contendo sacarose a 3%. - Tubos de ensaio. - Suporte para tubos de ensaio. - Recipiente para banho de gelo. - Papel alumínio. - Reagentes: # Etanol a 95%, detergente incolor, água destilada, cloreto de sódio.

Procedimento técnico Higienizar a boca, fazendo bochechos com água. Raspar mucosa com auxílio de um swab (nos dois lados bucais). Em um recipiente, colocar uma porção de solução de sacarose a 3% e, logo em seguida, bochechar esta solução por 2 minutos. Recolher o volume obtido do bochecho e colocar no recipiente anterior, mergulhando o swab usado na raspagem. Transferir 5,0ml do volume anterior para um tubo de ensaio e adicionar 01 pitada de cloreto de sódio, homogeinizando o material com auxílio de papel alumínio. Adicional 500µl de detergente neutro a 25% e homogeinizar vagarosamente. Incubar em banho-maria a 55ºC por 10 minutos. Resfriar em banho de gelo, por 10 minutos aproximadamente. Colocar no tubo de ensaio, delicadamente, 5,0ml de álcool etílico gelado a 95% e observar.

OBSERVAÇÕES A proteinase K é indispensável no material sanguíneo devido digerir proteínas e eliminar a contaminação das preparações de ácido nucleico, além de inativar as nucleases que poderiam degradar o DNA ou o RNA durante a purificação.

Extração de DNA: Na área de preparo de amostras. Separe a amostra em fragmentos que possam ser testados de forma independente Utiliza os métodos mais simples de extração, para evitar manipulação e possível contaminação Se tem quantidade suficiente de DNA ao final, faça sempre a eletroforese de uma pequena alíquota em gel de agarose para verificar a qualidade do DNA. Elimine o efeito de eventuais contaminantes que poderiam interferir com a eficiência da reação diluindo a amostra, e consequentemente, os contaminantes. Isso é possível, visto que 100 moléculas alvo já são suficientes para amplificação.

Extração de DNA Leucócitos, células de raspados epiteliais, lavado brônquico, pedaço de tecido, etc Centrifugação 1.400 g 4oC Solução de lise tamponada, contendo EDTA e um detergente, como Triton, por ex. Remova o sobrenadante Conserve o “pellet”

Digestão com Proteinase K Profa Dra Katia Karina Digestão com Proteinase K O DNA, nessa fase, se desprenderá das proteínas ligadas a ele, uma vez que estas são digeridas pela proteinase K Ressuspenda gentilmente o pellet em solução de digestão com proteinase K Incube a 37oC por no mínimo 2h ou 55oC por 1h

Após digestão com proteinase K, inative a enzima por aquecimento a 95-100oC por alguns minutos, e o DNA já está pronto para ser usado. Passos adicionais de purificação com fenol/clorofórmio seguida de precipitação com etanol, podem ser usados, mas não são necessários. O DNA pode também ser ulteriormente purificado com resinas que ligam DNA. Após eluir o DNA da resina, alguns resíduos de resina podem persistir, o que interefere com algumas reações enzimáticas envolvendo DNA. Centrifugue antes de pipetar, para não pipetar resíduos de resina.

Lise das células pode ser feita de vários modos: - fervura por alguns minutos - solução hipotônica (lise osmótica) - “freeze-thaw” - detergente: triton, nonidet 40, SDS - enzima: lisozima EDTA: quelante de Ca2+ e Mg2+, inibe a ação de DNAses

Material Parafinado: 1) Cortes de 5 a 10 m de espessura (3 a 5) (Lâmina perfeitamente limpa - passar etanol 100% - uma lâmina para cada novo bloco) Confirme a presença do tecido de interesse no último corte. 2) Retire o excesso de parafina em cada corte, com cotonete estéril ou algo similar, visualizando-o sobre uma lâmina limpa. 3) Transfira o restante do material para tubo Eppendorf - 1,5 mL 4) Adicione 1 mL de xileno, agite vigorosamente por 30 min, à temperatura ambiente (TA) 5) Centrifugue a 14.000 rpm - 3 min - TA. Remova o sobrenadante. 6) Repita os procedimentos de 4 e 5 por mais 2 vezes.

7) Lave 2 vezes com etanol (95 - 100%) para remover xileno Continuação: 7) Lave 2 vezes com etanol (95 - 100%) para remover xileno 8) Faça a digestão da amostra com proteinase K (200 g/mL) em 200 L de tampão de digestão. Incube a 37oC por 24 a 72 h, ou a 50oC por 3 - 4 h, sob leve agitação, acrescentando proteinase K (20 g/mL) até obter uma solução bem homogênea. 9) Centrifugue a 14.000 rpm por 5 min - TA. Transfira o sobrenadante para outro tubo - aí está seu DNA. Quantifique Analise através de eletroforese em gel de agarose.

QUESTÕES A SEREM ESCLARECIDAS Para que o uso do detergente? Para que o uso do sal? Por que o uso de álcool gelado? Qual a função da proteinase K? Porque avaliar leucócitos e desprezar os eritrócitos? Pode ser avaliado somente células vivas? Justifique sua resposta.