Utilização de Polimorfismos em Análises Forenses Emmanuella Rodrigues

Relembrando... Polimorfismo Genético  É a coexistência de alelos múltiplos em um lócus cromossômico; regiões do genoma nas quais existem variações entre as pessoas. Polimorfismo de sítio de restrição (RFLP) Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) Polimorfismos de inserção/deleção (indels) Polimorfismos de minissatélites (VNTR) Polimorfismos de microssatélites (STR)

Qual a importância desses polimorfismos? Fonte de variabilidade; Permitem construir um perfil genético indivíduo-específco  “DNA fingerprint”; importante em Medicina Forense

Por que analisar tais polimorfismos no DNA? Determinação de paternidade; Resolução de casos criminais envolvendo: Estupro; Homicídio; Rapto; Troca ou abandono de crianças.

De onde pode ser extraído o DNA? Sangue  padrão-ouro; células epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas de cigarro, selos e envelopes, gomas de mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...; Pêlos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo capilar); Unhas; Esfregaços;

De onde pode ser extraído o DNA? Manchas de material biológico: líquido seminal, urina, saliva, sangue; Tecidos de biópsias cirúrgicas; Ossadas (carbonizadas ou não); Tecidos mumificados ou congelados; Células deixadas por impressão digital; Dentes; outras

Como extrair o DNA? Técnicas específicas para cada tipo de amostra; CUIDADO: O sucesso da tipagem de DNA depende basicamente da qualidade e quantidade de DNA extraído

Métodos disponíveis para utilização: VNTRs estudados com sondas multilocais; STRs estudados com PCR; DNA mitocondrial (mtDNA); STRs do Cromossomo Y; Técnicas mais recentes.

VNTRs estudados com sondas multilocais Princípio do método: após clivagem por endonucleases, cada indivíduo tem um padrão de bandas específico com tamanhos determinados pela presença, ou não, do sítio da enzima e pela quantidade de repetições em tandem. Para que possa-se visualizar, esses fragmentos devem ser hibridizados a sondas radioativas de seqüência invariável.

VNTRs estudados com sondas multilocais

VNTRs estudados com sondas multilocais Técnica de custo razoável; DNA não degradado; Quantidade suficiente de DNA; Várias dificuldades inerentes à técnica.

VNTRs estudados com sondas multilocais   Teste de paternidade:

Identificação de um criminoso:

STRs estudados com PCR Princípio do método: Reação de PCR utilizada para copiar extensivamente várias regiões de STR, fornecendo fragmentos de tamanhos diferentes visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida ou por seqüenciamento

STRs estudados com PCR

Recuperação de DNA em amostras de tecidos e fluidos Amostra (tecidos e fluidos) Quantidade recuperada Análise de RFLP Análise de STR 1mL de sangue 20 a 40mg SIM Manchas de sangue seco de 1cm3 200ng NÃO Sêmen 150 a 300mg por mL Sêmen (esfregaço vaginal pós-coito) 0 a 3mg (DNA dos espermatozóides) Cabelo com raiz (contendo bulbo capilar) 1 a 750ng por fio Saliva 1 a 10mgpor mL Retirado de “Os exames de DNA nos Tribunais”, Revista Ciência Hoje (vol. 29, nº 169 - março/2001)

STRs estudados com PCR Vantagem sobre a técnica de VNTR: como o DNA é “amplificado”, a amostra a ser analisada pode ter uma quantidade inicial muito menor. Mesmo existindo contaminação por DNA de outras espécies, a técnica de PCR é específica o suficiente para amplificar apenas o DNA humano

OBS: Quantas regiões são necessárias?

mtDNA Características importantes: Também contém regiões polimórficas que permitem a “individualização”; Descendentes recebem apenas da mãe  permite traçar a linhagem materna de uma pessoa; É mais resistente à degradação que o DNA nuclear. taxa mutacional do mtDNA é 5-10 vezes maior que a do DNA nuclear  poucos mecanismos de reparo permitem que as variações nos nucleotídeos sejam acumuladas

mtDNA Princípio do método: Reação de PCR com o objetivo de copiar extensivamente regiões polimórficas presentes no DNA mitocondrial, analisado posteriormente por sequenciamento

mtDNA

mtDNA Utilizado quando a amostra em questão tem uma quantidade pequena ou não tem DNA nuclear;

mtDNA Utilizado na identificação de corpos em grandes desastres comparar a seqüência de interesse com a obtida nos possíveis irmãos ou ascendentes maternos; Identificação de maternidade sem o pai (p/ filhos e filhas) Não identifica um indivíduo específico; Estudos históricos ou evolutivos.

STRs crY Características importantes: Também contém regiões polimórficas que permitem a “individualização”; Homens recebem apenas do pai  permite traçar a linhagem paterna de um homem; Crossing-over com o crX em regiões homólogas entre os 2 cromossomos.

STRs crY

STRs crY Identificação de paternidade sem o pai (p/ filhos); Elucidação de estupro (mistura de DNA); Não identifica um indivíduo específico; Estudos históricos ou evolutivos;

Técnicas mais recentes SNPs Minisseqüenciamento; São muito numerosos; Baixa taxa de mutação; Requer maior nº de marcadores; Indels  Estudados em produtos de amplificação muito curtos (50pb ou menos)  vantagem sobre STRs em estudos de DNA extremamente degradado (ex: cadáver em estado avançado de decomposição ou carbonizado)

E no futuro... Bancos completos de perfil de criminosos OBS: Inglaterra CODIS – Combined DNA Index System (1994) Amostra de DNA  “retrato falado”