Seleção de macrofungos produtores das enzimas lignina peroxidase, manganês peroxidase, lacase, lipase, protease e epóxido-hidrolase Marcelo Müller dos Santos1, Maria Angela Lopes de Almeida Amazonas2, Nadia Krieger3, David Alexander Mitchell 4 1,3,4 Universidade Federal do Paraná, 2 Embrapa Florestas

1. Introdução  Como macrofungos, são consideradas todas as espécies de fungos que produzem corpos de frutificação visíveis a olho nu. A maior parte pertence à classe dos basidiomicetos e o restante aos ascomicetos.  Os basidiomicetos são os únicos organismos capazes de decompor eficientemente a lignina, daí o seu papel chave no processo de reciclagem de nutrientes nos ecossistemas florestais. Esta propriedade decorre da presença de enzimas lignolíticas entre o arsenal enzimático do metabolismo desses organismos. Além das enzimas lignolíticas, de interesse para a indústria de papel e celulose e processos de biorremediação, muitas outras encontram aplicação em processos biotecnológicos.

 Aplicação das enzimas estudadas: Lignina peroxidase, lacase e manganês peroxidase: processos de biorremediação (recuperação de solos contaminados e tratamento de efluentes, principalmente de origem têxtil); inústria de papel e celulose. Lipase: degradação de gorduras (indústria de detergentes); produção de compostos de alto valor agregado, como biodiesel, aromas, ésteres de sacarose, fármacos (p.ex.: ibuprofeno). Protease: degradação de substratos protéicos (indústria de detergentes), panificação, cervejaria, síntese de peptídeos. Epóxido-hidrolase: processos de detoxificação, síntese orgânica.

2. Objetivos  Investigação da ocorrência de enzimas de interesse biotecnológico em isolados de macrofungos depositados na coleção de culturas da Embrapa Florestas, Colombo, Paraná. 3. Estratégia  Técnicas simples e rápidas de detecção qualitativa de atividade enzimática estão sendo empregadas, de modo a permitir a triagem de um maior número de isolados em um curto espaço de tempo.

4. Material e Métodos  4.1. Teste para seleção de linhagens produtoras de lipase: O método baseia-se na complexação de ácidos graxos com o corante rodamina pela ação de lipases sobre o substrato (óleo de oliva).

Placa com corante rodamina e substrato (óleo de oliva)  Os pontos de hidrólise são visualizados quando as placas são irradiadas a 360 nm. Tempo de cultivo: 7 dias Irradiação a 360 nm Inóculo Placa com corante rodamina e substrato (óleo de oliva) Reação positiva

4.2. Teste para a seleção de linhagens produtoras de protease:  O método baseia-se na hidrólise da gelatina usada como substrato juntamente com o ágar nutriente.  A gelatina não hidrolisada precipita em solução saturada de (NH4)2SO4 ; assim é possível visualizar se há atividade proteolítica. Tempo de cultivo: 7 dias Placa de ágar nutriente com gelatina Halo de hidrólise

5. Resultados  Linhagens de macrofungos avaliadas quanto à produção de lipase. G. do complexo lucidum (Curitiba, PR), G. orbiformum (Paranaguá, PR), G. australe (Colombo, PR). Pleurotus eringii (Fuzhou, China), P. djamor (Polo Base, RR), Pleurotus floridanus (Paranaguá, PR) Polyporus arcularius (Polo Base, RR) Pereniporia martiusii (S.J. dos Pinhais, PR) Oudemansiella canarii (Curitiba, PR) Hennigsia brasiliensis (Curitiba, PR) Trametes versicolor (Barão de Cotegipe, RS) Stropharia rugosoannulata (Colombo, PR) Hypholoma subviride (Colombo, PR) Agaricus blazei ABL 97/11, 99/25, 99/26, 99/28, 99/29, 99/30 (Botucatu, SP) e CNPF 72 (Colombo, PR). Lentinus crinitus (Colombo, PR), L. strigellus (Colombo, PR), L. strigosus (Polo Base, RR), L. velutinus (Balsa Nova, PR). Lentinula boryana (Quatro Barras, PR), L. edodes LE1 (Londrina, Japão), L. edodes 697 (Tottori, Japão). Ganoderma do complexo lucidum (Chapada dos Veadeiros, GO),

 Linhagens de macrofungos avaliadas quanto à produção de protease. Agaricus blazei ABL 97/11, 99/25, 99/26, 99/28, 99/29, 99/30 (Botucatu, SP) e CNPF 72 (Colombo, PR). Lentinus crinitus (Colombo, PR), L. strigellus (Colombo, PR), L. strigosus (Polo Base, RR), L. velutinus (Balsa Nova, PR). Lentinula boryana (Quatro Barras, PR), L. edodes LE1 (Londrina, Japão), L. edodes 697 (Tottori, Japão). Ganoderma do complexo lucidum (Chapada dos Veadeiros, GO), G. do complexo lucidum (Curitiba, PR), G. orbiformum (Paranaguá, PR), G. australe (Colombo, PR). Pleurotus eringii (Fuzhou, China), P. djamor (Polo Base, RR), Pleurotus floridanus (Paranaguá, PR) Polyporus arcularius (Polo Base, RR) Pereniporia martiusii (S.J. dos Pinhais, PR) Oudemansiella canarii (Curitiba, PR) Hennigsia brasiliensis (Curitiba, PR) Trametes versicolor (Barão de Cotegipe, RS) Stropharia rugosoannulata (Colombo, PR) Hypholoma subviride (Colombo, PR)

 Os macrofungos que produziram uma ou ambas as enzimas avaliadas estão sendo cultivados em substrato sólido em frascos de Erlenmeyer para a produção de corpos frutíferos.  A linhagem de Agaricus blazei CNPF 72 está sendo cultivada em fermentação submersa para quantificação e caracterização da protease produzida.

 Padronização do Inóculo para Agaricus blazei  técnica de homogeneização do micélio:

6. Etapas Futuras  Testar outras 30 linhagens da coleção quanto à produção de lipase e protease.  Selecionar linhagens produtoras de lacase, lignina peroxidase, manganês peroxidase.  Selecionar linhagens produtoras de epóxido-hidrolases.