Human-Human Hybridoma Autoantibodies with Both Anti-DNA and Rheumatoid Factor Activities Aluna: Paula Fernandes Carneiro Professor: Michel Gantus

Artrite reumatóide Artrite reumatóide (AR) - doença inflamatória crônica caracterizada por poliartrite simétrica, principalmente das mãos, associada à rigidez matinal e fadiga. Em alguns casos outros órgãos e sistemas, além das articulações, podem estar envolvidos, como os olhos (uveíte), pulmões (pneumonite), glândulas salivares e lacrimais (síndrome de Sjögren) e sistema nervoso periférico (neuropatias). Cerca de metade dos pacientes com AR apresentam incapacidade para o trabalho após dez anos de doença.

Nos casos de quadro clínico progressivo e inflamação persistente pode ocorrer morte prematura. Diagnóstico precosse – tratamento mais eficiente - impedir a incapacidade na maioria dos pacientes. 0,5% a 1% da população. AR - início - qualquer idade - maior incidência: mulheres entre 40 e 50 anos. 5 mulheres – 2 homens. Membrana que envolve a articulação (sinovial) - processo inflamatório intenso caracterizado por hipertrofia do tecido e transformação funcional das células componentes desta membrana, os sinoviócitos. membrana sinovial normal – 1 camada de tecido Inflamada – até 10 camadas (macrófagos e fibroblastos transformados)

Lúpus eritematoso sistêmico 2 formas: 1) não apresentar erupções cutâneas, porém compromete os órgãos internos e é a forma mais grave da doença. O processo inflamatório sistêmico é capaz de afetar articulações, pele, pleura, pericárdio, sistema nervoso central, rins, coração, pulmões e outros órgãos. lúpus eritematoso cutâneo crônico (discóide) - envolvimento cutâneo (geralmente na face) - erupção em forma de “asa de borboleta” e/ou pápulas eritematosas, escamosas, que formam lesões anulares na cabeça e/ou partes do corpo quando expostas ao sol.

lúpus – início - febre, perda de peso, fadiga, mal-estar. etiopatogenia do lúpus - conjugação de fatores genéticos e ambientais envolvidos em sua eclosão. fatores genéticos - hormônios sexuais e anormalidades imunológicas. fatores ambientais - drogas; luz ultravioleta (UV); infecções viróticas e bacterianas; estresse, fatores étnicos e sócio- econômicos - colaborar para desencadear ou exacerbar o início da doença. Lúpus - quadro clínico crônico - longa duração e sem cura efetiva - alternando entre períodos de atividade e remissão do quadro.

Introdução Fator reumatóide (FR) - anti-imunoglobulinas IgG – reação com IgG autólogos e heterólogos. FR - 70% dos pacientes com artrite reumatóide (AR), 30% dos pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) e em pacientes com outras doenças do tecido conjuntivo. FR - pode ser encontrada em pacientes com doenças inflamatórias crônicas, como tuberculose, hanseníase, sífilis, endocardite subaguda, e salmonelose, e em outros condições associadas com hipergamaglobulinemia ou imunocomplexos circulantes.

A origem e a função dos anticorpos antiimmunoglobulinas (FR) - desconhecida. Estudos sobre FR monoclonais e policlonais isolado do soro têm mostrado que a FR pode reagir com uma variedade de outras substâncias que IgG, incluindo grupos de nitrofenil e desnaturar DNA (dDNA), nucleossomas, complexo nucleoproteíco DNA, as histonas, etc. A base do estes reação cruzada é difícil de explicar, uma vez que estes antígenos não parecem apresentar uma homologia estrutural significativa com IgG. Hibridoma de autoanticorpo Homem-humano, derivados de pacientes com AR e LES - isolar e analisar FR monoclonal individuais e determinar suas reatividade com outros antígenos. A natureza das reações cruzadas destes anticorpos hibridoma com diferentes antígenos pode fornecer informações importantes sobre as propriedades do sítio de ligação do antígeno e os mecanismos responsáveis pela produção e patogenia de tais anticorpos.

Métodos fusão Seleção de hibridomas produtores de auto-anticorpos para dDNA, nDNA e Fc RIA em fase sólida para a ligacao do anicorpo a dDNA e nDNA Competição de ligação do FR hibridoma para tubos revestidos por Fc HIgG, dDNA e BSA Preparação de imunoglobulinas Purificação de fragmentos de Fac e Fc de IgG humana RIA em fase sólida para IgG de FR Focalização isoelétrica de hibridomas de auto-anticorpos

Resultados A fusão de LSP de 4 pacientes com AR e 5 pacientes com LES com o linfoblasto GM clones de hibridomas. AR - 4 fusões clones 2 anti-DNA 1 FR 6 anti-DNA e RF. LES - 5 fusões com - 95 clones 3 anti-DNA 0 FR 5 anti-DNA e RF A freqüência de clones de produzir tanto anti-DNA e RF foi 6 / 167 (4%) para a AR e 5 / 95 (5%) para LES. Produção anticorpos de hibridomas anti-DNA e FR através de pacientes com LES e AR.

Ligação de anticorpos hibridoma para dDNA e nDNA RA 8 dDNA 2 nDNA SLE 8 dDNA 2 nDNA

RIA em fase sólida para anticorpos IgM e fragmentos Fc RA – 3 fracos SLE – 1 náo vincula Fc

Competição de ligação do hibridoma RFpara tubos de Fc- revestido por hIgG, dDNA e BSA Competição HIgG e dDNA, mas não pela BSA. A) HIgG foi melhor competidor que dDNA. B) dDNA foi melhor competidor que HIgG.

hibridoma que não reage com dDNA.

Focalização isoelétrica

Discussão hibridoma humano - anti-DNA e FR. Dos 262 hibridomas - pacientes com AR e LES - 17 hibridomas - dDNA e fragmento Fc de IgG humano. Ligação - dDNA e Fc – anticorpo monoclonal - focalização isoelétrica géis e imunoabsorção. A dupla reatividade dos auto-anticorpos - experimentos de competição. Estes ensaios de competição apoiam a visão de que uma auto-anticorpos pode ter reatividade dupla. Os resultados do presente trabalho fornecer suporte para sitios de ligação de antígenos para dDNA e HIgG que estão próximas e, eventualmente, se sobrepõem. A elucidação da base molecular da reação cruzada de anticorpos é essencial para a compreensão do potencial de reatividade antigênica desses anticorpos in vitro e in vivo. O uso de anticorpos hibridoma oferece o potencial para designar verdadeira reação cruzada desses anticorpos e, finalmente, definir o antígeno relevante nestas doenças auto-imunes.

Obrigada!