Técnicas em Imunologia Parte I Métodos Laboratoriais em Imunologia Prof.Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Colheitas Utilizar o tubo correcto Sangue /plasma Anticoagulante apropriado EDTA Citrato heparina Soro Com activador da coagulação Com activador da coagulação e gel separador do coágulo e soro Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Soro Coagulação deve ser completa Cerca de 30 a 60 minutos em tubo sem anticoagulante Cerca de 15 a 30 minutos em tubo com activador da coagulação Mais se o indivíduo estiver com hipocoagulação natural ou induzida Centrifugar os tubos 10 min a 1,000-1,200g-22ºC Guardar a 4ºC excepto para CH50 e crioglobulinas Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Que tubo utilizar? Preparação de leucócitos Habitualmente utilizar anticoagulante (qual depende do teste) Purificar as células Preservar as células Fenotipagem  4ºC Cultura/estudos funcionais Transportar o sangue a RT rápidamente Preparar as células rápidamente Cultivar/testar de imediato Prof. Doutor José Cabeda

Outros tipos de Amostra (I) Urina (muito raro) CSF Saliva Liquidos de: Sinovial, pleura, pericárdio, peritoneu, BAL Utilizar Tubo c/ EDTA ou sem anticoagulante Prof. Doutor José Cabeda

Outros tipos de Amostra (II) Biópsias (aspirados por agulha fina) Nódulos linfáticos Medula óssea Tumores etc Utilizar Tubo c/ EDTA ou Com heparina Prof. Doutor José Cabeda

Amostras que necessitam de processamento especial Complemento Congelar a –20ºC até 2 horas após colheita Crioglobulinas Colhido em tubo morno, estéril e sem anticoagulante Mantido a 37ºC até ser testado Prof. Doutor José Cabeda

O que deve acompanhar a amostra Identificação completa do doente no tubo e na requisição (ou código claro e unívoco) Sexo, data de nascimento Exame requisitado Patologia suspeita Tipo de amostra Data e hora da colheita Nome,código e assinatura do Médico requisitante Prof. Doutor José Cabeda

Razões de rejeição de amostras Colheita inapropriada Tubo errado Condições de manutenção/transporte incorrectas Informação incorrecta/ilegível no tubo Informação no tubo discordante da requisição Hemólise Volume insuficiente Amostra coagulada (em tubo com anticoagulante) Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas baseadas em Imunoglobulinas Ligação dos anticorpos é específica Anticorpos podem ser conjugados com um vasto leque de enzimas e marcadores Constituem excelentes reagentes para a identificação sensível e específica de ligandos Permitem o estudo do historial imunológico de um índivíduo Prof. Doutor José Cabeda

Anticorpos como reagentes Preparação de Anticorpos policlonais Inoculação/estimulação de animais Adjuvantes Que animal Que via de inoculação/estimulação Colheita, preparação e teste do soro Estimulação repetida leva a uma maturação da especificidade do Ab Prof. Doutor José Cabeda

Anticorpos como reagentes Preparação de anticorpos monoclonais Estimular animais como anteriormente Colher Linfoblastos B Fazer experiências de diluição limite Preparar hibridomas com estas células Fazer experiências de diluição limite dos hibridomas Testar cada clone para especificidade Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas em Imunologia Parte I Métodos Laboratoriais em Imunologia Prof.Doutor José Cabeda

Técnicas baseadas em imunoglobulinas Ensaios Liquídos (ensaios homogéneos) Difração da luz Nefelometria turbidimetria Outros ensaios liquidos EMIT CEDIA Imunofluorescência Aglutinação Quimioluminescência Ensaios Sólidos (ensaios heterogéneos) ELISA Competitivo Não-competitivo indirecto RIA Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas baseadas na difracção da luz Nefelometria Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a quantidade de luz difractada devido à presença de complexos imunológicos O ângulo de difracção e o comprimento de onda são aspectos importantes 31º permite melhor razão sinal/ruído Imunoturbidimetria Baseada na reacção de imunoprecipitação Mede a diminuição de luz que consegue atravessar uma solução na presença de complexos imunológicos O detector está sempre alinhado com a fonte de luz (0º), pelo que a medida não é da luz difractada, mas da não difractada Prof. Doutor José Cabeda

Curva de imunoprecipitação Assumindo: Ig pelo menos bivalentes IgG Antigénio com pelo menos 2 epitopes Se Ab em excesso, um aumento de Ag implica um aumento da reacção Se Antigénio em excesso, um aumento de antigénio diminui a probabilidade de um Ab ligar 2 antigénios, o que diminui a precipitação A quantificação só é possível se o anticorpo estiver em excesso Prof. Doutor José Cabeda

Cinética da Curva de imunoprecipitação A reacção inicia-se imediatamente, sendo visivel 20s após a adição do antigénio A reacção prossegue de modo aproximadamente linear até que a precipitação dos complexos origina uma aparente diminuição da reacção Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Rate Nephelometry [Ab] é constante Aumento progressivo da [antigénio] Deve ser realizada na zona de excesso de Ab Em nefelómetros automáticos deste tipo, 2 [antig] são inicialmente ensaiadas. Dependendo do resultado: São testadas novas [] É testada o excesso de antig Prof. Doutor José Cabeda

End-point nephelometers Medida no ponto máximo da reacção Medida de branco ou no inicio da reacção Valor intrapolado de uma curva de calibração Variações Particle enhanced Prof. Doutor José Cabeda

Particle enhanced nephelometry São utilizadas particulas de latex conjugadas com anticorpo ou antigénio competidor Aumento de sensibilidade Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Ensaios Requisitos Qualquer fluido Soro Plasma Urina CSF Deve ser diluído (para não interferir na leitura) Amostras ricas em lipídios devem ser clarificadas por filtração ou ultracentrifugação Amostras ictéricas ou hemolisadas Não afectam a nefelometria Afectam a turbidimetria Prof. Doutor José Cabeda

Outro ensaios homogéneos CEDIA (Cloned enzyme donor assay) b-galactosidade em 2 fragmentos inactivos enzyme donnor Enzyme acceptor A reacção imune junta-os activando a enzima. Se não houver antigénio o anticorpo liga-se à enzima inactivando-a EMIT (Enzyme multiplied immunoassay technique) Aumento ou diminuição da actividade enzimatica com a reacção Ag-Ab Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Imunofluorescência Anticorpos conjugados com compostos fluorescentes Conjugado utilizado como revelador directo Aumento de 10 a 1000 vezes na sensibilidade Grande aumento na rapidez de detecção Vantagens relativamente à RIA: Tão sensivel Reagentes mais estáveis Mais fácil de implementar Prof. Doutor José Cabeda

Principais fluorocromos utilizados Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas de imunofluorescência (I) Directas Anticorpo directamente conjugado Indirectas Anticorpo secundário conjugado Acopladas Duas reacções acopladas Fluorescence polarization immunoassay Baseia-se no aumento na polarização da luz emitida quando um antigénio-FITC forma complexos imunes, o que se deve às restrições ao movimento rotacional do antigénio no complexo Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas de imunofluorescência (II) Fluorescent Quenching assay Método competitivo directo que utiliza [ab] fixa Competição para o ab entre o antigénio marcado e o não marcado (a testar) A fluorescência é absorvida (quenched) quando o antigénio marcado se liga ao anticorpo A intensidade de fluorescência é uma medida da quantidade de antigénio não marcado que competiu para o anticorpo Método indirecto Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas de imunofluorescência (III) Substrate labelled Fluorescent immunoassay Método indirecto Analito ligado a um modulador que influencia o sinal gerado Actividade do modulador influenciada pela ligação do Ab Prof. Doutor José Cabeda

Técnicas de imunofluorescência (IV) Fluorescent energy transfer immunoassay Método competitivo Analito conjugado com FITC Anticorpo ligado a Rodamina Se o analito conjugado ligar ao anticorpo, por ressonância a energia do FITC excita a rodamina Se por competição, o analito impedir o anticorpo de se ligar ao conjugado, não haverá excitação da rodamina Prof. Doutor José Cabeda

Problemas da imunofluorescência Autofluorescencia Proteinas do soro (320-350nm) Bilirubina (430-470nm) Urina apresenta elevada linha de base Para obviar a estes problemas pode-se Tratar a amostra com Enzimas proteoliticas Agentes oxidantes Agentes desnaturantes Quenching Bilirrubina Hemoglobina Fotodestruição Diminuição da fluorescência ao longo da excitação Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Aglutinação Baseada na reacção ag-ab Observada visualmente Tipos: Directa (ABO) IgM aglutina várias RBC IgG necessita de reagente de Coombs (anti-human-ab) para fazer a ponte Indirecta ou passiva Antigénio ligado a subtância inerte Reversa Anticorpo ligado a substância inerte Prof. Doutor José Cabeda

Aglutinação de partículas Mais sensiveis que a aglutinação Mensurável por nefelometria, turbidimetria, contagem de particulas Anticorpo ou antigéneo conjugado com particulas de látex Reacção ag-ab aglutina as particulas que saem de solução A medida das partículas em solução é inversamente proporcional ao titulo a determinar Prof. Doutor José Cabeda

Ensaio quimioluminescente Produção de luz por uma reacção quimica, habitualmente uma reacção de oxidação-redução O modo mais sensível de detecção em imunoensaios (atomole=10-18 a zeptomole=10-21) Compostos utilizados: Esteres de acridina (detecção do NaOH e H2O2) Limite de detecção de 0.5 atomoles Derivados do isoluminol (detecção com H2O2 e um catalizador) Limite de detecção de 50 atomoles Prof. Doutor José Cabeda

Enzimas utilizadas em ensaios quimioluminescentes Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Ensaios em fase sólida ELISA Competitivo Não competitivo-indirecto Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Ensaios em fase sólida ELISA Sandwich ou de captura Prof. Doutor José Cabeda

Resolver problemas do ELISA Prof. Doutor José Cabeda

Electroforese de Imunoglobulinas Electroforese em agarose de alta resolução Imunofixação Imunosubtracção Electroforese capilar Prof. Doutor José Cabeda

Electroforese de Ig em agarose Electroforese + Corar com Ponceau S e secar Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Imunofixação Electroforese Aplicação de tira de acetato decelulose com anticorpo monoespecifico para cada cadeia de Ig. Forma-se um precipitado onde houver Ig correspondente Proteinas não pp são lavadas Corar os pp com amido black nigrosin Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Imunosubtracção Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Crioglobulinas (I) Tipo I Monoclonal (IgG, IgM, IgA, raramente c.leves) Tipo II Mistas (2 ou mais Ig, sendo uma monoclonal) Tipo III Policlonal Prof. Doutor José Cabeda

Prof. Doutor José Cabeda Crioglobulinas (II) Prof. Doutor José Cabeda