MARCADORES MOLECULARES BASEADOS EM DNA Alberto José Prioli Sônia Maria Alves Pinto Prioli Nupélia - Universidade Estadual de Maringá

DNA mitocondrial Marcadores Moleculares RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP DNA mitocondrial

RAPD SPAR Microssatélites DNA mitocondrial Marcadores Moleculares NÃO exige conhecimento prévio do genoma Exige um conhecimento parcial do genoma

RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP DNA mitocondrial Marcadores Moleculares RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP Simples, Baixo Custo Imenso Número de Locos Mas... Dominantes Trabalhoso Alto Custo Co-Dominantes ! ? Custo Haplóide; Alto No Cópias Herança Materna Não Recombina Evolução Rápida DNA mitocondrial

ESTES MARCADORES MOLECULARES ? COMO OBTER ESTES MARCADORES MOLECULARES ?

DNA – Estrutura e Replicação A seqüência de bases codifica a informação genética. Com um molde e um primer a DNA polimerase sintetiza um novo polinucleotídeo. A necessidade de um primer per- mite a síntese in vitro (PCR) de fragmentos de interesse.

O resultado é lido em gel. PCR – Reação da Polimerase em Cadeia Taq-polimerase dNTP Mg2+ Tampão Primers DNA Ciclos com mudanças de temperatura A repetição d o ciclo amplifica o o número de cópias do segmento entre os sítios do par de primers. O resultado é lido em gel.

Hot springs -Yellowstone National Park -USA

A “picture” of the bacteria

PCR (Polymerase Chain Reaction) Mullis & Faloona, 1987; Saiki et al., 1985. Eficiência na detecção de polimorfismo. Síntese enzimática de milhões de cópias na presença da DNA pol. Reação: anelamento e extensão com um par de primers sintetizados artificialmente. CICLO Desnaturação Anelamento Extensão

Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso RAPD Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso Técnica desenvolvida por Williams et al. (1990). Primer curto e arbitrário. Não se sabe, antecipadamente, em em quais posições do genoma ocorrerão pareamentos. A amplificação é garantida por sítios de iniciação próximos e em fitas opostas. Cada fragmento amplificado é uma característica binária do indivíduo ou da população. Vantagens principais: baixo custo, grande número de locos e não há necessidade de qualquer conhecimento prévio do genoma do organismo.

Loco RAPD é um segmento amplificável, incluindo os dois sítios de iniciação. Cada loco pode ser tratado como um sistema de DOIS ALELOS A configuração do segmento que resulta em amplificação é o ALELO DOMINANTE A configuração que não amplifica é o ALELO RECESSIVO (nulo) A INFORMAÇÃO OCULTA PELA DOMINÂNCIA É PERDIDA: não há como saber se a população está em equilíbrio de HW, pois os heterozigotos não podem ser identificados.

Marcadores RAPD

Parâmetros desenvolvidos para marcadores co-dominantes podem ser estimados com RAPD, admitindo-se equilíbrio de Hardy-Weinberg. Exemplos: Distâncias genéticas Índice de fixação FST (diferenciação genética) Número de migrantes (Nm) ... Para amostras pequenas, a metodologia de Lynch e Milligan (1994) miniminiza o erro introduzido pela suposição de equilíbrio.

Estas análises não protegem contra a perda Nem sempre é necessária a suposição de equilíbrio. Índices de similaridade (Jaccard ou outro) Coordenadas principais Componentes principais Componentes de variância da AMOVA Diversidade de Shannon . . . Estas análises não protegem contra a perda da informação oculta pela dominância.

Usar RAPD? O RAPD gera estimativas menos Se para a espécie ainda não existem marcadores mais eficientes, decide-se diante da relevância e urgência. O RAPD gera estimativas menos precisas, mas é muito útil como ferramenta exploratória e em combinação com marcadores mais informativos.

RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP DNA mitocondrial Marcadores Moleculares RAPD SPAR AFLP Microssatélites RFLP Simples, Baixo Custo Imenso Número de Locos Mas... Dominantes Trabalhoso Alto Custo Co-Dominantes ! ? Custo Haplóide; Alto No Cópias Herança Materna Não Recombina Evolução Rápida DNA mitocondrial

Escolha da Seqüência (Qual é o Objetivo?) Marcadores Moleculares Mitocondriais Metodologia Escolha da Seqüência (Qual é o Objetivo?) DNA Total Amplificação via PCR Clonagem do Fragmento Seqüenciamento Seqüência: Edição e Alinhamento

Geralmente evolui 5-10 vezes mais rápido do que mtDNA Geralmente evolui 5-10 vezes mais rápido do que genes nucleares de cópia simples. Alta velocidade de evolução - No Transição > Transversão CO I, II, III e Citocromo b = Evolução + lenta (conservados) ND, ATPases = Evolução menos lenta (~menos conservados) tRNAs = Evolução lenta; pequenos (59-75 bp) (primers) rRNAs = Evolução lenta (interessantes p/ espécies distantes) D-Loop ou Região Controle = Mais variável do mtDNA.

FRAGMENTOS D-loop DE 450 pb de Astyanax (lambari)

ELETROFEROGRAMA (EDIÇÃO NO COMPUTADOR) Picos com as cores correspondentes a cada nucleotídeo.

OBTENÇÃO DE INFORMAÇÕES ECOLÓGICAS COM MARCADORES MOLECULARES

Molecular Markers and Genetic Variability of Hoplias aff Molecular Markers and Genetic Variability of Hoplias aff. malabaricus Populations from the Floodplain of Upper Paraná River PRIOLI1,2*, Alberto J.; LUCIO1, Léia C.; MANIGLIA1, Thiago C.; PRIOLI1,2, Sônia M. A. P.; JÚLIO Jr1,2, Horácio F.; PAZZA1, Rubens; PRIOLI1,3, Laudenir M. 1Nupélia – Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura; 2Depto. Biol. Celular e Genética; 3Depto. Biologia – Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900 Maringá, PR, Brazil. *Autor para correspondência (Phone: 44-261-4750; Fax: 44-263-1424; e-mail: ajprioli@nupelia.uem.br)

Planície de inundação do alto rio Paraná Sete Quedas Base Nupelia-UEM em Porto Rico - PR Sete Quedas Reservatório de Itaipu Foz do Iguaçu

Reservatório de Itaipu Planície de inundação do alto rio Paraná Base Nupelia-UEM em Porto Rico - PR Sete Quedas Reservatório de Itaipu Foz do Iguaçu

Atualmente ocorrem três citótipos de Hoplias aff Atualmente ocorrem três citótipos de Hoplias aff. malabaricus na planície alagável do alto rio Paraná: A (42) C (40) D (39/40) macho/fêmea O citótipo C invadiu a planície depois do barramento de Itaipu.

Figure 1 – DNA fragments amplified by PCR with SPAR primer (GGAC)3T, identifying Hoplias aff. malabaricus cytotypes A, C, and D from the floodplain of Upper Paraná River. (L) Molecular weight markers (Ladder 100 bp); (b) negative control without DNA.

Dados sobre Citótipo C na planície Conclusão Figure 2. Neighbor-joining tree for mitochondrial control region sequences of Hoplias malabaricus specimens from the Upper Paraná River Foodplain. Genetic distance was computed by using Tamura and Nei (1993) method. Number on each node indicates bootstrap probability based on 1000 replications.

O monitoramento com ISSR evidenciou que o grupo C é o mais freqüente na planície, nos ambientes lóticos, semi-lóticos e lênticos.