Sumário Propriedades das enzimas: relação enzima – substrato Condições necessárias na actividade enzimática. Mecanismos de inibição enzimática. Síntese dos principais processos associados à Biotecnologia no diagnóstico e terapêutica de doenças. Lisboa, 30 de Abril de 2009 Produção de alimentos e sustentabilidade A CTIVIDADE ENZIMÁTICA Professora estagiária Margarida Flores Martins

ENZIMA Metabolismo celular A vida dos microrganismos, como aliás, a de todos os sistemas biológicos, depende de um conjunto de reacções que, de forma ordenada, ocorrem em cada instante e constituem o metabolismo celular. Catabolismo Há degradação de compostos orgânicos complexos em compostos orgânicos mais simples, com libertação de ATP. São reacções exoenergéticas. Ex: digestão, renovação celular Anabolismo Há formação de substâncias mais complexas a partir de substâncias mais simples. Há consumo de ATP, que se libertou pelo catabolismo e que não foi usado. São reacções endoenergéticas. Ex: crescimento, síntese de proteínas

História ENZIMA Catálise biológica início séc. XIX digestão da carne: estômago; digestão do amido: saliva. Década de 50 Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela levedura era catalisada por fermentos = enzimas. Eduard Buchner (1897) extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool; enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula viva. James Sumner (1926) Isolou e cristalizou a urease; Cristais eram de proteínas; Postulou que todas as enzimas são proteínas. John Northrop (década 30) Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas; Década de 50 – séc. XX 75 enzimas isoladas e cristalizadas; Ficou evidenciado caráter protéico. Atualmente enzimas são conhecidas

Substâncias que aumentam a velocidade de uma reacção sem serem consumidas mecanismo: diminuição da barreira de energia de activação A adição de um catalisador não altera a posição de equilíbrio mas apenas a velocidade em que o equilíbrio é atingido. Características ENZIMA/BIOCATALIZADOR

Estrutura ENZIMA RNA Estrutura Enzimática Ribozimas Se covalente Apoenzima ou Apoproteína Holoenzima Cofator Proteína Pode ser: íon inorgânico molécula orgânica Coenzima Grupo Prostético Cofator

ENZIMA Energia de activação

Vias metabólicas ENZIMA

Acção ENZIMA As enzimas... Aceleram reações químicas Ex: Decomposição do H 2 O 2 Condições da Reação Energia livre de Ativação KJ/mol Kcal/mol Velocidade Relativa Sem catalisador Platina Enzima Catalase 75,2 18,0 48,9 11,7 23,0 5,5 1 2,77 x ,51 x 10 8

H2O2H2O2 H2OH2O O2O2 + Catalase E S E + S E PE + PE PE + P Acção ENZIMA Não são consumidas na reacção….. A catalase é um enzima; O enzima catalase decompõe o peróxido de hidrogénio em água e oxigénio molecular; A polpa de batata contém catalase; A imersão de polpa de batata em peróxido de hidrogénio resulta na libertação de bolhas gasosas.

Acção ENZIMA

Atuam em pequenas concentrações 1 molécula de Catalase decompõe de moléculas de H 2 O 2 pH = 6,8 em 1 min Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto por uma única molécula de enzima em uma dada unidade de tempo. Acção ENZIMA

Diferença entre a energia livre de S e P Caminho da Reação Energia de ativação com enzima Energia Energia de ativação sem enzima S P Não alteram o estado de equilíbrio Baixam a energia de ativação; Keq não é afetado pela enzima. Não apresenta efeito termodinâmico global G não é afetada pela enzima. Acção ENZIMA

Apresentam alto grau de especificidade; Características ENZIMA São produtos naturais biológicos; Reações baratas e seguras; São altamente eficientes, acelerando a velocidade das reações (10 8 a rápida); São econômicas, reduzindo a energia de ativação; Não são tóxicas; Condições favoráveis de pH, temperatura, polaridade do solvente e força iônica.

Centro activo ENZIMA A reacção ocorre no centro activo: – contém os resíduos de aminoácidos directamente envolvidos na reacção; – ocupa uma parte relativamente pequena do volume total da enzima; – trata-se de uma entidade tridimensional; – corresponde, geralmente, a uma cavidade na molécula de enzima, com um ambiente químico muito próprio. – o substrato entra no sítio activo e liga-se à enzima através de interacções fracas, não covalentes

Especificidade ENZIMA

Especificidade ENZIMA A especificidade das enzimas varia muito de uma enzima para outra, sendo muito baixa para algumas enzimas e muito alta para outras. Especificidade relativa: Quando esta relação existe apenas em relação a tipos de ligação, como certas peptidases, fosfatases, podendo-se citar a lipase que hidrolisa as ligações ácido-alcóol de quase todos os ésteres orgânicos. Especificidade absoluta: Tipo de especificidade exclusiva, isto é, quando uma enzima actua somente sobre um determinado composto, como a urease que hidrolisa a ureia, mas nenhum dos seus derivados, ou a tripsina que hidrolisa apenas ligações peptídicas formadas por grupos carboxílicos dos aminoácidos básicos.

Modelo de Fischer ou Modelo Chave/Fechadura: prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação, que seria rígido como uma fechadura. Modelos ENZIMA

Modelo de Koshland ou Modelo do encaixe induzido: existe um sítio de ligação não totalmente préformado, mas sim moldável à molécula do substrato – a enzima ajusta-se à molécula do substrato na sua presença, sendo complementar ao seu estado de transição Modelos ENZIMA

Evidências experimentais sugerem um terceiro modelo que combina o ajuste induzido a uma "torção" da molécula do substrato, que o "activaria" e o prepararia para a sua transformação em produto. Modelos ENZIMA

Componente não proteíco ENZIMA

Inibição competitiva ENZIMA O inibidor liga-se ao centro activo, competindo com o substrato, e diminuindo a actividade da enzima.

Inibição não competitiva ENZIMA O inibidor liga-se numa região distinta do centro activo, afectando-o, e diminuindo a actividade da enzima.

Inibição alostérica ENZIMA A ligação do indutor provoca modificações no centro activo, permitindo a actuação enzimática. Algumas enzimas além dos centros activos, possuem centros alostéricos (centros reguladores), onde se ligam inibidores que não têm estrutura semelhante ao substrato.

Século XIX - poucas enzimas identificadas ASE Adição do sufixo ASE ao nome do substrato: Ex: - gorduras (lipo - grego) – LIPASE - amido (amylon - grego) – AMILASE Nomes arbitrários: - Tripsina e pepsina – proteases Classificação ENZIMA

Classificação ENZIMA Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB) nomear e classificar. Cada enzima código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada: 1° dígito - classe 2° dígito - subclasse 3° dígito - sub-subclasse 4° dígito - indica o substrato

Factores que influenciam actividade enzimática ENZIMA

pH O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. Enzimas grupos ionizáveis, existem em estados de ionização.

A temperatura ótima para que a enzima atinja sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui uma atividade cte. por um período de tempo. TEMPERATURA temperatura dois efeitos ocorrem: (a) a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas; (b) a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica. O efeito da temperatura depende: - pH e a força iônica do meio; - a presença ou ausência de ligantes.

CONCENTRAÇÃO DAS ENZIMAS Velocidade de transformação do S em P qtidade de E. Desvios da linearidade ocorrem: Presença de inibidores na solução de enzima; Presença de substâncias tóxicas; Presença de um ativador que dissocia a enzima; Limitações impostas pelo método de análise. Recomenda-se: Enzimas com alto grau de pureza; Substratos puros; Métodos de análise confiável.

CONCENTRAÇÃO DOS SUBSTRATOS [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P. Medir Vo = velocidade inicial da reação. [E] = cte. [S] pequenas Vo linearmente. [S] maiores Vo por incrementos cada vez menores. Vmax [S] Vo insignificantes. Vmax é atingida E estiverem na forma ES e a [E] livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não com de [S]. vo Vmax

INIBIDORES REVERSÍVEISIRREVERSÍVEIS COMPETITIVOS NÃO COMPETITIVOS INCOMPETITIVOS

Cinética enzimática ENZIMA

Victor Henri (1903): E + S ES K1K1 K -1 ES KpKp Etapa rápidaEtapa lenta E + S E + P Em 1913: Leonor Michaelis -Enzimologista Maud Menten - Pediatra

Enzimas Vs Catalisadores químicos ENZIMA

CaracterísticaEnzimas Catalisadores Químicos Especificidade ao substratoaltabaixa Natureza da estruturacomplexasimples Sensibilidade à T e pHaltabaixa Condições de reação (T, P e pH)suavesdrástica (geralmente) Custo de obtenção (isolamento e purificação)altomoderado Natureza do processobateladacontínuo Consumo de energiabaixoalto Formação de subprodutosbaixaalta Separação catalisador/ produtosdifícil/carasimples Atividade Catalítica (temperatura ambiente)altabaixa Presença de cofatoressimnão Estabilidade do preparadobaixaalta Energia de Ativaçãobaixaalta Velocidade de reaçãoaltabaixa

TIPOS DE APLIÇÕES INDUSTRIAIS Alimentos Rações animais Papel e celulose Couro Têxtil Aplicações ENZIMA

ALIMENTOS Indústria de azeite de oliva: - Aplicação de polygalacturonase e pectinesterase na melhoria de aspectos organolépticos e estabilidade a longo prazo. Panificação: - Melhoria de cor, sabor e estrutural através de preparado enzimático que contém alfa-amilase fúngicas. Atua sobre a farinha de trigo, acelerando o processo de fermentação devido a uma maior formação de açúcares para o fermento.