Técnicas de Eletroforese Rodrigo Rocha Latado

Eletroforese Diversos métodos para análise de: Ácidos nucléicos (DNA e RNA) Proteínas Enzimas

ETAPAS Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR, Proteínas, etc...) Preparar o gel Aplicar as amostras no gel Eletroforese Coloração do gel, Fixação, Documentação

- carga elétrica e tamanho da molécula (partícula) CLASSIFICAÇÃO Tipos: - agarose - poliacrilamida desnaturante não desnaturante - amido (para isoenzimas) Princípios: - carga elétrica e tamanho da molécula (partícula) - pH (focalização isoelétrica)

Detecção: Visualização: brometo de etídeo, SYBR, nitrato de prata, fluorescência substratos específicos (isoenzimas) Visualização: UV, direta, câmera

Eletroforese Sharp, Sambrook and Sugden

Eletroforese Syber green Singer VL, Lawlor TE, Yue S. 1999. Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat. Res. 439(1):37-47. Syber green http://www.probes.com/servlets/product?region=0&item=7563

Àcidos Nucléicos Ácido nucléico exposto a campo elétrico migra para eletrodo na velocidade ou mobilidade proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula mobilidade: inversamente proporcional ao coeficiente friccional coeficiente friccional: função do tamanho e forma da molécula e viscosidade do meio

Eletroforese Moléculas separadas por: tamanho forma ou conformação magnitude de cargas Sob pH fisiológico -> fosfatos ionizados poliânions correm em direção ao eletrodo positivo Eletroforese pólo negativo -> pólo positivo

Eletroforese

Eletroforese Tamanho da Molécula de DNA DNA linear migra inversa/ proporcional ao log10 do seu peso molecular

Eletroforese AGAROSE: polissacarídeo linear de galactose com unidades de b-D-galactopiranose com ligações 1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose PM médio: 120.000 Da

Agarose

Eletroforese em gel de agarose - Tampão (TAE ou TBE) e agarose - Concentração agarose varia entre 1 e 3% - Fundir a agarose no tampão e aplicar na fôrma - Esperar esfriar, retirar o pente - Aplicar as amostras no gel - Iniciar a eletroforese

Eletroforese Tampões: água eletrolisada gerando H+ no anodo e OH- no catodo terminal catódico (+) -> básica terminal anódico (-) -> ácida requer tampão para evitar gradientes de pH

Eletroforese

Eletroforese TAE TBE para recuperação de fragmentos preferido moléculas maiores menor campo de força maior porosidade TBE preferido para moléculas menores < 1Kb interage com agarose - poros menores

Eletroforese Voltagem expressar sempre em V cm-1 gradiente de voltagem - distância entre eletrodos voltagem excessiva - rastro de banda voltagem baixa - difusão de bandas pequenas <1 Kb TBE - bandas pequenas mais finas TAE - bandas maiores

Eletroforese

Eletroforese Tempo de corrida correr gel até banda de interesse ter migrado de 40 a 60% do comprimento do gel parte inferior do gel - difusão e dispersão

Eletroforese Tampão de Carregamento: Concentração 6 a 10x aumentar densidade da amostra - depositar amostra no fundo do poço adicionar cor a amostra adicionar corantes de mobilidade ou migração azul de bromofenol xileno cianol verde de bromocresol

Eletroforese- Poliacrilamida

GEL DE POLIACRILAMIDA - Géis de Poliacrilamida são obtidos a partir da formação de ligações entre o polímero acrilamida e o co-monômero bis-acrilamida. - Essa reação covalente é geralmente catalizada por persulfato de amônio e iniciada por TEMED, uma amina terciária. - Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser obtida através de variações de: Concentração de acrilamida e bis-acrilamida Grau de polimerização

GEL DE POLIACRILAMIDA - A matriz de poliacrilamida por possuir poros menores do que a matriz de agarose, géis de acrilamida são usados para separar fragmentos de DNA menores que 2 kpb, enquanto que moléculas de até 200 kpb podem ser separaradas em géis de agarose. - De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp, enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1 a 0,05 Kpb.

Eletroforese

ACRILAMIDA DESNTAURANTE - Acréscimo de Uréia no gel para a manutenção do DNA na forma de fita simples - Amostras de DNA são desnaturadas a 94 -96o C, na presença de Formamida, antes da eletroforese