Características do DNA Formado por fita dupla complementar; 5´ 3´ 3´ 5´
Características do DNA Capacidade de autoreduplicação; Formado por bases nitrogenadas (A, C, G e T);
Introdução ao PCR Reação da Polimerase em Cadeia Outubro de 1985 (idéia em 1983) Publicado na American Society of Human Genetics criado por Kary B. Mullis
Características do PCR Amplificação de Seqüências de DNA ou RNA Processo Cíclico 15 a 40 ciclos realizado por mudança de temperatura
Produção de DNA por PCR Produção de 2 a 4 mg DNA em 1-3 hs específico = amplifica sequência-alvo na presença de DNA genômico sensível = detecta inclusive 1 sequência de molde (DNA ou RNA) flexível = muitas variações da técnica básica de PCR
Requerimentos Básicos do PCR 1. Molde - DNA ou RNA 2. DNA polimerase 3. dNTPs 4. Iniciadores de Oligonucleotídeos (Primers)
Função dos Iniciadores Primers fornecer grupo 3’ OH para iniciar a síntese de DNA definir os limites do segmento de DNA-alvo a ser amplificado estabelecer especificidade
Oligos Iniciadores Primers sintetizados quimicamente tipicamente entre 15 a 25 bases define limites de alvo a amplificar prévio conhecimento da sequência alvo primer de seqüências aleatórias
Ciclos de Temperatura no PCR Anelamento do Primer Tm Desnaturação Extensão 94oC do Primer 72oC
Desnaturação do DNA 94 a 100oC desnaturar inicialmente o DNA alvo desnaturar produtos de ciclos prévios duração de 30 s a 1 min
Anelamento do Primer 40 a 70oC temperatura de “hibridização” otimização da temperatura para cada par de primer composição = %G+C determina especificidade do produto amplificado tipicamente 30 s a 2 min
Extensão do Primer 72oC Taq polimerase faixa de atividade: 20oC a 85oC atividade varia 100x nessa faixa Tempo de extensão varia de acordo com tamanho do produto desejado
Exponencialidade do PCR Caso ideal: N = No 2n N = número de moléculas amplificadas No = número inicial de moléculas n = número de ciclos de amplificação
Amplificação Geométrica Ciclo Número Fita Duplas produzidas 1 0 5 8 10 256 15 8.192 20 262.144 25 8.388.608 30 268.435.456 35 8.589.934.589 40 274.877.906.800