MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DA DIVERSIDADE MICROBIANA Anderson Barbosa Hadja Radtke Mariana Uchoa Tammy Arai Florianópolis, 24 de junho de 2010

Introdução Homogeneidade Riqueza • Diversidade microbiana – bactérias, protozoários, fungos e algas unicelulares Diversidade Homogeneidade (abundância relativa de cada grupo) Riqueza (no de grupos presentes) • Maior diversidade: muitas espécies em abundância relativamente igual

• Temos pequena idéia da nossa real diversidade microbiana • Inventário atual da biodiversidade mundial – muito incompleto (vírus, microorganismos e invertebrados) 1,7 milhões de espécies vivas no planeta Representam apenas 1 a 10% de todas as espécies de bactérias 5.000 espécies identificadas de procariotos • Temos pequena idéia da nossa real diversidade microbiana

• Solo talvez seja habitat mais explorado para isolamento de microorganismos • Fontes naturais diversas oferecem ambientes ricos para exploração – água doce, matéria orgânica, sedimentos, folhas, frutos...

Grande diversidade fenotípica e genética das comunidades do solo – uma das mais difíceis de estudar 1% da população bacteriana do solo pode ser cultivada através das práticas comuns de laboratório Análise da diversidade de um ambiente: Estudos dependentes de cultura Estudos independentes de cultura X

Estudos dependentes de cultura • Bactérias isoladas de amostras do ambiente através de meio de cultura – ácido nucléico extraído • Problema: microorganismos viáveis mas não cultiváveis (não são metabolicamente inertes: sintetizar proteínas e usar substratos)

Estudos dependentes de cultura • São limitados - apenas bactérias que podem ser cultivadas • Não refletem a real estrutura da comunidade microbiana Maioria das bactérias será excluída quando diversidade for estimada

Métodos independentes de cultura • Extração direta dos ácidos nucléicos das amostras do ambiente – métodos moleculares • amplificação do DNA extraído por PCR e análise da diversidade das moléculas amplificadas: “fingerprinting” • produtos podem ser clonados e sequenciados: identificar e enumerar as espécies de bactérias presentes % muito maior de microorganismos, que não é cultivada em laboratório

Limitações dos métodos moleculares Primeiros requisitos e obstáculo a ser superado: extração e purificação dos ácidos nucléicos • método de extração do DNA ou RNA usado: muito suave gram + não são lisadas; muito severo DNA pode ser danificado • separação das células microbianas dos componentes do solo: substâncias inibitórias (ácidos húmicos) – se co-extraídas interferem na PCR Podem influenciar a análise e interpretação dos resultados das avaliações moleculares

Métodos para medir a diversidade microbiana no solo: Técnicas bioquímicas Técnicas moleculares Conteúdo de guanina + citosina Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização Microarranjos ou microchips de DNA DGGE – TGGE SSCP ARDRA / RFLP T-RFLP RISA / ARISA Contagem em placas Nível fisiológico da comunidade (CLPP) Microradioautografia Atividade enzimática do solo Analise de ácidos graxos (FAME)

Contagem de placas e Níveis fisiológicos da comunidade Diluição da amostra Representa apenas microorganismos cultiváveis Favorece organismos de rápido crescimento Só representa os organismos capazes que utilizar a fonte de carbono escolhida Mostra o potencial de diversidade metabólica e não a diversidade in situ . Escolher condições de crescimento ótimas abrangentes Impossibilidade de cultivar grande quantidade de espécies Favorescimento de microorganismos com crescimento mais acelerado. Inoculação na placa Contagem dos viáveis Análise da capacidade da comunidade microbiana em utilizar determinadas fontes de carbono

Microradioautografia e FISH Através da quantidade absorvida por uma célula de um substrato específico marcado radioativamente, pode-se detectar e quantificar a população ativa que está usando esse substrato. FISH (Fluorescence in situ hybridization) usada para detectar a presença de uma sequência específica de DNA nos cromossomos. Usa-se um marcador fluorescente que liga-se à sequência escolhida e, através da microscopia de fluorescência pode-se visualisar a marcação. Permite elucidação da função ecológica dos microorganismos Permite elucidação da filogenética dos microorganismos

Atividade enzimática do solo As enzimas encontradas naturalmente no solo provém, principalmente, de microorganismos, apesar de resíduos animais e vegetais também serem uma possível fonte. Exoenzimas Atividade enzimática Endoenzimas São avaliadas as atividades de enzimas do solo associadas: ao ciclo do carbono b-glucosidase do fósforo fosfatase ácida do enxofre arilsulfatase Dessa forma, pode-se associar a atividade enzimática com o papel ecológico do microorganismo presente no solo

Análises dos ácidos graxos Esse método informa sobre a composição da comunidade microbiana baseado em grupos de ácidos graxos. coleta - Ácidos graxos - Ácidos graxos específicos de grupos taxonômicos saponificação Perfil metilação Uma mudança no perfil da comunidade significa uma mudança na microbiota extração lavagem Análise por cromatografia de gás

Técnicas moleculares para o estudo da diversidade microbiana Conteúdo guanina + citosina Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização Microarranjos de DNA Técnicas de PCR DGGE – Eletroforese em gel de gradiente desnaturante

Técnicas moleculares para o estudo da diversidade microbiana SSCP – Polimorfismo de conformação de fita simples RFLP/ARDRA – análise de restrição do DNA ribossomal amplificado T-RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminais RISA - Análise de espaçador intergênico ribossomal Rep-PCR – caracterização de sequências altamente repetitivas ou microssatélites

Conteúdo guanina + citosina Diferenças na quantidade de guanina + citosina no DNA Diversidade bacteriana de comunidades do solo Diferem entre 3% e 5% Grupos taxonomicamente relacionados diferem em apenas 3 a 5% na quantidade de G+C Proporciona um nível grosseiro de resolução, uma vez que grupos taxonomicos diferentes podem compartilhar uma mesma série G+C

Conteúdo guanina + citosina Vantagens de análises G+C Sem influência de PCR Inclui todo o DNA extraído Pode detectar membros raros de uma comunidade Método quantitativo

Conteúdo guanina + citosina Análise de mudanças na diversidade microbiana no solo havaiano Mudanças na diversidade microbiana de um ambiente coberto por florestas para pastos Estudo revelou que as plantas têm uma forte influência na composição da comunidade microbiana

Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização DNA total é extraído, purificado e desnaturado A taxa de hibridização ou reassociação depende da similaridade das sequências Tempo relacionado com a diversidade Importante ferramenta qualitativa e quantitativa na ecologia molecular bacteriana Se a complexidade ou a diversidade das sequencias de DNA aumentarem, a taxa de reassociação do DNA irá diminuir O tempo necessário para para metade do DNA se reassociar pode ser usado como um índice de diversidade, já que leva em conta tanto a quantidade quanto a distribuição da reassociação de DNA A similaridade entre duas comunidades de amostras diferentes pode ser estudada através da medida do grau de similaridade do DNA por hibridização cinética

Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização Sondas de ácidos nucleicos Sondas são pequenas porções de DNA (ou RNA) de sequência conhecida usadas para identificar a presença de DNA complementar na amostra A ligação das 2 fitas (sondas + amostra ) se denomina HIBRIDIZAÇÃO Hibridização pode ocorrer em suportes sólidos ou líquidos Sonda é uma “assinatura das seqüências genéticas de um organismo ou um gene” Ocorre pareamento espontâneo resultante da complementaridade das bases é o princípio das técnicas usadas para detectar e caracterizar genes. Tecnologia das sondas gênicas é usada para identificar genes individuais ou sequencias de DNA. Duas fitas devem ter pelo menos 16-20 bases complementares consecutivas para formar uma fita estável e complementar. 1. Sondas podem ser marcadas com: radioisotopos,enzimas, fluorocromo, substratos quimioluminescentes.

Reassociação de ácidos nucléicos e hibridização Desvantagens Pouca sensibilidade Sequências necessitam de um grande número de cópias para serem detectadas

Microarranjos ou microchips de DNA Microarranjos de DNA “DNA microarrays” Coleção de porções de DNA aderidas a suportes sólidos (vidro, plástico ou silicone) formando um conjunto que visa monitorar a expressão de múltiplos genes. Essa ferramenta pode ser de grande valor na diversidade bacteriana, uma vez que um único arranjo pode conter milhares de sequencias de DNA Esses microarranjos podem também conter genes específicos, servindo como alvos. Exemplos: nitrato redutase, nitrogenase ou naftalina dioxigenase, proporcionam informações da diversidade funcional ou podem conter amostras de padrões ambientais representados por diferentes espécies

Microarranjos ou microchips de DNA

Microarranjos ou microchips de DNA

DGGE e TGGE DGGE – Eletroforese em gel de gradiente desnaturante ( denaturing gradient gel electrophoresis) TGGE – Eletroforese em gel de gradiente de temperatura (temperature gradient gel electrophoresis)

DGGE e TGGE Analise de produtos de PCR de acordo com suas sequências de pares de base* DGGE utiliza géis de poliacrilamida contendo um gradiente linear de desnaturantes ( uréia e formamida) TGGE utiliza um gradiente térmico com concentração constante de uréia e formamida * E não com diferenças no tamanho dos produtos

DGGE e TGGE Técnica rápida, relativamente barata e reproduzível A sequência de nucleotídeos de um fragmento de DNA definirá a posição no gradiente em que o DNA de fita dupla irá desnaturar-se passando a fita simples, interrompendo sua migração no gel moléculas de DNA, com sequencias diferentes, apresentam taxas de migraçao diferentes em géis

SSCP Fitas simples formam estruturas secundárias que dependem do seu comprimento e da sequência de bases Detecção por autorradiografia dos produtos do PCR com marcadores radioativos ou por coloração com nitrato de prata Vantagens e desvantagens similares ao DGGE Algumas fitas podem formar mais de uma conformação SSCP – Polimorfismo de conformação de fita simples

RFLP/ARDRA RFLP/ARDRA – análise de restrição do DNA ribossomal amplificado

RFLP/ARDRA Enzimas de restrição – fragmentos de restrição Separação por gel agarose Southern blot - Hibridização a um DNA de prova e detecção com moléculas radioativas ou fluorescentes Detecção de genótipos: MM Mm mm Útil para detectar mudanças estruturais nas comunidades bacterianas mas não para medir a diversidade ou detectar grupos específicos (Extração, PCR)

T-RFLP Mesmo princípio da RFLP Um primer do PCR é marcado com uma substância fluorescente Leitura do padrão de banda simplificada Uso de sequenciador automático – altamente reproduzível Possibilita a análise de comunidades complexas e a coleta de informações sobre a diversidade, mas pode trazer distorções aos resultados (escolha primer) TET e 6-FAM T-RFLP – Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminais

RISA/ARISA Região IGS entre as subunidades ribossomais 16S e 23S Heterogeneidade – útil para diferenciar estirpes bacterianas diferentes e espécies muito próximas RISA requer muito DNA, marcador de prata pode ser insensível ARISA ainda possui as limitações tradicionais do PCR ARISA – fluorescencia RISA - Análise de espaçador intergênico ribossomal

Rep-PCR Sequencias de DNA repetidas de 1-10 pb - microssatélites Pode servir para diagnóstico da espécie ou linhagem Sequência deve ser conhecida para uso do primer apropriado Rep-PCR – caracterização de sequências altamente repetitivas ou microssatélites

Considerações finais • Grande número de métodos disponíveis para estudar diversidade microbiana do solo • Cada método tem suas limitações – fornece apenas um retrato parcial • Aconselhável utilizar uma variedade de métodos, incorporando resultados de métodos tradicionais e moleculares