Cromossomos Sexuais - X e Y Determinação e Diferenciação Sexual Genética II Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

Cromossomo X Estrutura funcional: Ross et al. (Nature, 2005) 5% genoma nuclear (160 Mb), SUBMETACÊNTRICO 99,3% da sequência eucromática do X 1098 genes codificantes  699 genes conhecidos baixa densidade gênica: 7,1genes/Mb genes funcionais em ambos os sexos.

ESTRUTURA FUNCIONAL DO CROMOSSOMO X

Evolução dos cromossomos sexuais Ohno (1967): cromossomos sexuais de mamíferos  evoluiram de um par de autossomos (300 milhões anos) Isolamento da região determinante do sexo no Y barreira para recombinação entre X e Y: divergência  acúmulo de mutações no Y e degeneração  deleções XCR: região conservada do X (descendente do autossomo) XAR: região adicional do X (adição de outro autossomo)

Consequência da Falta de Recombinação X-Y Aquisição de genes específicos a masculinidade → envolvidos apenas na espermatogênese Perda gradual de genes homólogos ligados ao X Redução do Y → remoção de sequências redundantes Mecanismo de conversão gênica → compensar a falta de recombinação X-Y Infertilidade masculina → deleção esporádica ocasional de genes essênciais envolvidos na espermatogênese

Anomalias estruturais do cromossomo X Deleções Região Xcen-q13 Isocromossomos Isodicêntricos Isocromossomos Xp Região Crítica ausente. Telocêntricos Xp Centro de Inativação do X (Xic), sem a qual o cromossomo não pode formar o corpúsculo de Barr e permanece ativo. Região Crítica

1 cromossomo X em cada célula somática da mulher é inativado Inativação do X Fêmeas (46,XX)  2 cópias de cada gene ligado ao X Machos (46,XY)  apenas 1 cópia  desvantagem? Hipótese Lyon (1960) 1 cromossomo X em cada célula somática da mulher é inativado Compensação de Dose

- estágio de blastocisto - contagem dos cromossomos X  células 46,XY e 45,X  nenhum X inativado. - células 46,XX e 47,XXY  1 X inativado.

Cromatina Sexual - corpúsculo de Barr Corpúsculo de Barr ou Cromatina Sexual  Cromossomo X inativo no núcleo interfásico. Cromatina Sexual - corpúsculo de Barr

- machos  hemizigotos e fêmeas  funcional/e hemizigotas. - escolha é ALEATÓRIA (exceto células das membranas extra-embrionárias) é FIXADA. Desvio da Inativação: Manifestação clínica variável em mulheres heterozigotas para doenças ligadas ao X  desde absolutamente normal até totalmente afetada

 Fêmea adulta: mosaico de clones derivados de diferentes células embrionárias. Machos e fêmeas homozigotas → pelagem preta ou laranja Fêmeas heterozigotas → pelagem malhada

Mecanismos de inativação do X - XIC (centro de inativação do X) em Xq13  locus controla a iniciação e a propagação (contagem e escolha)  evento epigenético  silenciamento transcricional de um dos cromossomos X em células somáticas - X sem o XIC  não são inativados - XIST (Xist)  X-Inactivation-Specific Transcript  RNA de 17 kb  codificado pelo X inativo  atua sobre o cromossomo X inativado. - X anormal com dois XIC  corpúsculo de Barr bipartido. - t(X;aut) contendo XIC  espalhamento parcial da inativação do X. Mecanismos de inativação do X

STRACHAM, 2002

A INATIVAÇÃO DO X REQUER ALGUMAS ETAPAS: 1. Iniciação: locus XIST sobre cada cromossomo X é expressado, de modo que a transcrição é interrompida em um dos crs. X, mas é mantida no outro  X inativado (cromatina sexual). Regulação de XIST no X ativo  regulado em cis por um gene antisense Tsix  bloqueia o acúmulo e espalhamento de XIST no Xa Hipermetilação do DNA do Xi nas ilhas CpG (silenciamento) Metilação  Genes housekeeping (constitutivos): regiões 5´ promotoras  dinucleotídeos C-G  Ilhas CpG.  Metilação extensa (enzima: DNA-metiltransferase) inativa a transcrição.

2. Espalhamento bidirecional  passagem de alguns sinais a longa distância de uma maneira cis, sem afetar o outro cromossomo. 3. Manutenção da inativação modificações na conformação da cromatina. hipoacetilação e metilação de histonas do nucleossomo do Xi: heterocromatina (cromatina compactada transcricionalmente inativa)  replicação tardia

a) antes da inativação: XIST é expresso em uma forma instável, fatores bloqueadores impedem sua regulação (gene antisense Tsix) b) RNA XIST se estabiliza, há regulação transcricional ou ocorre liberação dos fatores bloqueadores. c) espalhamento RNA XIST sobre o X antes da sua inativação. d) modificações da cromatina: hipoacetilação e metilação das histonas, metilação dos promotores dos genes ligados ao X  X inativo. e) silenciamento transcricional dos genes devido ao espalhamento do RNA XIST Obs.: no futuro Xa  persistência de Tsix prevenindo a formação da cobertura de XIST sobre o Xa a b c d e

MECANISMOS DE ESTABELECIMENTO E MANUTENÇÃO DO ESTADO INATIVO A- Xist associa-se c/ X em cis → recruta complexos proteínas para silenciamento inicial (hipoacetilação de histonas) → reversível B- Xist recruta outros complexos de proteínas (metilação de histonas) → manutenção do estado inativo → reversível C- Recrutamento de fatores p/ manutenção das modificações das histonas e induzir outras mudanças epigenéticas (metilação região promotora do DNA) → ESTADO INATIVO IRREVERSÍVEL

REATIVAÇÃO DO CROMOSSOMO X - Cromossomo X inativo é reativado nos ovócitos pouco antes da meiose. Genes que escapam da inativação: principalmente em Xp (PAR) STS - enzima esteróide sulfatase (ictiose). MIC 2 ZFX A1S9T RPS4X MIC2 STS ZFX A1S9T RPS4X Primeiro foram submetidos ao processo de inativação e posteriormente sofreram reativação

VARIABILIDADE NA EXPRESSÃO DE GENES DO CROMOSSOMO X Mulheres expressam diferentes genes do Xi: heterogeneidade do nível de expressão entre as mulheres Explicação para algumas diferenças comportamental e biológica entre mulheres e entre homens e mulheres Carrel & Willard (2005): estudo de 95% de genes do X em fibroblastos de 40 mulheres:

75% genes: submetidos a inativação 10% genes: padrão variável de inativação entre as mulheres e expressados diferentemente em alguns Xi 15% genes (94) do Xi escapam da inativação (todas mulheres): diferindo nas regiões do X Distribuição não casual de genes que escapam da inativação ao longo do cromossomo X: principalmente Xp distal → aneuploidias de Xp mais severa que Xq

Doenças ligadas ao X: reconhecidas pelo padrão de herança Associado com grande número de doenças: 10% das doenças mendelianas www.nature.com/news/2005

Cromossomo Y acrocêntrico (70 Mb) Gene ancestral Sox3 heterocromatina constitutiva (maior parte) DNA não codificador, alta e moderada/e repetitivo → conversão gênica → recombinação com o próprio Y pobre em genes (~251 genes) maioria dos genes controlam a função sexual. desaparecimento em 5-10 milhões de anos???

ESTRUTURA DO CROMOSSOMO Y 1- Região pseudo-autossômica maior (PAR1)  mantém-se ativa no X inativo. - extremidade dos braços curtos do X e do Y - homologia de 2,7 Mb; - contém cerca de 12 genes não submetidos a inativação frequência alta de recombinação na meiose masculina sítio de crossing-over obrigatório 2- Região pseudo-autossômica menor (PAR2): - 330 kb na extremidade dos braços longos do X e do Y (recombinação não obrigatória) - Alguns genes submetidos a inativação Deleções dos fatores de azoospermia(Yq11): AZFa, AZFb e AZFc: infertilidade

Regiões homólogas de X e Y. Região eucromática do X: 6 x maior que do Y Outras regiões de homologia Xp21.3 e Yq proximal região Yp-Xq região Yq-Xq Regiões homólogas de X e Y.

Cromossomo Y determinação sexual em humanos - Eventos que evidenciam que o Y é responsável pela determinação do sexo masculino: a- indivíduos 45,X  mulheres b- indivíduos 47,XXY  homens Y garante o fenótipo masculino, independente/e do número de crs. X. c- indivíduos 46,X,iso(Yq) ou del(Yp)  mulheres com fenótipo de S. Turner. Yp  fatores determinantes do sexo masculino

3- Região Yp - TDF (próximo à PAR1) - ZFY proteína zinc-finger - SRY  região do Y determinante do sexo  outros genes do Y - Yp - fator STS (esteróide sulfatase) - fator Xg -Yq - gene para o tamanho da coroa dentária, gene da estatura - AZF  previne a azoospermia

ANTIGOS CANDIDATOS A TDF - FATOR DETERMINANTE DO TESTÍCULO Pesquisa sobre TDF no Y humano a- gene ZFY  proteína zinc-fingers  atua como fator de transcrição (TF).  homens XX, porém negativos para ZFY  excluiu-o como candidato.  ZFY: homologia em Xp com ZFX  escapa da inativação nas fêmeas.

b- gene SRY  novo candidato a TDF  diferentes análises genéticas: - gene determinante do sexo - presente e conservado em diferentes organismos - proteína sry: apenas em testículos  fator de transcrição  regula expressão de outros genes SRY SRY

Mapa do cromossomo Y Factor Determining Testis - TDF

Estudos em camundongos transgênicos  transferência do SRY clonado para um oócito fertilizado XX macho XX 33.17 XY-m 33.09 XX-F 33.13 XX- m 33.17 33.13 SRY controle ZFY Animais transgênicos para o gene SRY: 33.17 macho XY e 33.13  macho XX

Estudos em Homens 46,XX – Sexo Reverso mutações em SRY - cariótipo 46,XY - fenótipo feminino avaliação cromossômica em homens 46,XX cromossomo X com o gene SRY crossing defeituoso.

Avaliação cromossômica em homens 46,XX Crossing durante a meiose Região pseudo- autossômica Região crossing raro Avaliação cromossômica em homens 46,XX

SRY: DETERMINAÇÃO DO SEXO MASCULINO SEXO REVERSO

DETERMINAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO SEXUAL Determinação Sexual: relacionada com o desenvolvimento das gônadas (testículo ou ovário) processo que inicia-se com a gametogênese dos progenitores até a diferenciação gonadal específica de cada sexo Diferenciação Sexual: Resulta no desenvolvimento das genitálias até o desenvolvimento das características sexuais secundárias

É MENINO OU MENINA? 1 em 3000 crianças nasce com intersexo

CLASSIFICAÇÃO DOS NÍVEIS SEXUAIS Sexo genético: 46,XX ou 46,XY Sexo gonadal: testículos e ovários Sexo genital interno: -ovário: trompas de Falópio, útero e metade ou 2/3 superiores da vagina -testículos: epidídimo, vasos deferentes, vesículas seminais e ducto ejaculatório Sexo genital externo: -ovário: permanecem sem indução (fêmeas) -testículos: próstata, pênis e uretra peniana, escroto e testículos Sexo psicológico e social: identidade e desempenho pessoal Caracteres sexuais secundários e alterações pubertárias: -mulheres: pêlos axilares e púbicos, seios, menstruação, etc -homens: pêlos axilares e púbicos, barba, alteração da voz, etc

DETERMINAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO SEXUAL Embrião (6a. - 7a. Semana): gônadas bissexuais Genes reguladores:a partir da 7a. s -SRY (Yp) -WT1 (11p13) Tumor de Wilms -SOX9 (17q) -DSS (Xp21) diferenciação ovariana -DAX-1 (X) hipoplasia adrenal congênita Diferenciação sexual: completa ~12-14 semanas

GENES ENVOLVIDOS NA DETERMINAÇÃO SEXUAL SRY: não é o único responsável pela determinação sexual Fetos XY SRY+ → desenvolvido como fêmea -SOX9 (17q24): expressado cedo no desenvolvimento fetal → (duas cópias) essencial p/ desenvolvimento dos testículos e outros órgãos reprodutores masculinos. Fêmeas camundongos transgênicas (cópia adicional Sox9 →sexo reverso fêmea → macho) -SOX3 (Xq26-q27): pode reprimir ou interferir com o promotor de testículo SOX9 -DMRT1 (9p24.3): duas cópias → desenvolvimento dos testículos → deleção leva → sexo reverso (homem → fêmea XY) -DAX1 (Xp21.3): gene anti-testículo (efeito feminilizante)→ cópia adicional (duplicação Xp) → sexo reverso (homem → fêmea XY) -WT1 (11p13) e SF1 (9q34): diferenciação da crista urogenital

Células de Leydig(8a. s.: testosterona) Ductos de Wolff (condutos deferentes, epidídimo, vesícula seminal e próstata) Células de Sertoli (7-9a.sem:HAM) regressão dos Ductos de Muller

trompas, útero, porção superior da vagina

CLASSIFICAÇÃO DAS ANORMALIDADES DA DIFERENCIAÇÃO SEXUAL 1-Disgenesia gonadal (erros no sexo gonadal) S. Turner e S. Klinefelter Disgenesia gonadal pura (S. Swyer) Disgenesia gonadal mista Hermafroditismo verdadeiro Sexo reverso ou homem XX

HERMAFRODITISMO Presença de tecido ovariano e testicular, genitália ambígua maioria dos casos: ovotestis (uni ou bilateral) cariótipo típico: 46,XX (SRY-) pequena porcentagem: quimeras (células XX e XY de diferentes zigotos) 2/3 casos: genitália externa masculina rara presença de espermatozóides Presença de útero e menstruação

HERMAFRODITISMO Características: frequentemente presença de útero condutos genitais conforme gônadas presentes genitália externa ambígua ou masculinizada, hipospadia, criptorquidia hérnia inguinal (ovotestis ou testículo) ginecomastia na puberdade menstruação em alguns casos caracteres sexuais secundários femininos incompletos

CLASSIFICAÇÃO DAS ANORMALIDADES DA DIFERENCIAÇÃO SEXUAL 2- Pseudo-hermafroditismo feminino Hiperplasia congênita da adrenal (AR) -deficiência da 21-hidroxilase -deficiência da 21-hidroxilase com perda de sal 3- Pseudo-hermafroditismo masculino Deficiência de produção de testosterona Defeito do metabolismo dos andrógenos Ex. S. de insensibilidade completa aos andrógenos (S. feminização testicular)

PSEUDO-HERMAFRODITISMO FEMININO Incidência: 1:5000 nascimentos Gônadas: ovários cariótipo feminino: 46,XX genitália interna feminina: ovários, útero e trompas de Falópio genitália externa masculinizada em grau variável (ou ambígua)  virilização da genitália na vida fetal Ex. Hiperplasia congênita da adrenal (AR) -biossíntese do cortisol: superprodução de esteróides com atividade androgênica (deficiência da 21--hidroxilase)

PSEUDO-HERMAFRODITISMO MASCULINO Incidência: 1:65.000 sexo masculino Gônadas: testículos (testosterona normal) cariótipo masculino: 46,XY fenotipicamente mulheres (mamas, amenorréia primária, ausência dos derivados de Müller) anomalias das gônadas e condutos genitais genitália externa alterada: feminilizada ou ambígua (vagina em fundo cego) Ex. S. da insensibilidade androgênica completa (S. de feminização testicular) herança recessiva ligada ao X: ausência ou defeito da função de receptores andrôgenicos nos órgãos alvo