PAPEL DA DIPEPTIDIL PEPTIDASE IV NA REABSORÇÃO DE SAIS E ÁGUA EM TÚBULO RENAL Adriana Castello Costa Girardi

Sequência da Aula Visão Geral da Função Renal Isoforma 3 do Trocador Na/H (NHE3) Dipeptidil Peptidase IV (DPPIV) Modulação do NHE3 pela DPPIV DPPIV e Função Renal Novas linhas de investigação

Principais Funções dos Rins no Organismo Regulação da osmolaridade e do volume dos fluidos corporais; Regulação do balanço eletrolítico; Regulação do balanço ácido-base; Excreção dos produtos metabólicos e substâncias exógenas; Produção e secreção de hormônios. Os rins são órgãos excretores e reguladores.

A Unidade Funcional dos Rins é o Néfron. A unidade funcional dos rins é o nefro. Todo rim humano contém aproximadamente 1,2 milhões de nefros. O nefro consiste de (1) corpúsculo renal, (2) túbulo proximal; (3) alça de Henle; (4) túbulo distal; (5) sistema de ductos coletores. Cada segmento do nefro é formado por células diferenciadas especificamente para realizar funções de transporte específicas. As células do TP têm uma membrana apical extensivamente ampliada chamada de borda em escova. A membrana basolateral é altamente invaginada e contém muitas mitocôndrias. Em contraste células do segmento fino ascendente.

Túbulo Proximal 1,5 L/dia

Modelo Proposto NHEs

NHE3 Cl- - Filtrado Glomerular + Circulação sistêmica Célula de túbulo proximal Capilar peritubular 3Na+ Na+ 2K+ NHE3 H+ HCO3- 3 HCO3- Na+ H2CO3 HCO3- + H+ H2O + CO2 a.c. NaCl NaHCO3 H2O a.c. - CO2 + H2O Cl- Na+ H+ NHE3 3Na+ 2K+ Na membrana luminal há um mecanismo de troca Na+ x H+ (NHE – Na+ - H+ exchanger). A reabsorção de Na+ por este mecanismo é muito significativa em termos quantitativos. Aproximadamente 70% do Na+ reabsorvido em transportes acoplados em túbulos proximais o é por este mecanismo. A proteína envolvida neste processo, clonada pela primeira vez em 1989, pertence a uma família de proteínas na qual 8 membros já foram identificados em tecidos de mamíferos. Em membrana citoplasmática de células renais foram identificadas 4 isoformas destas proteínas (NHE 1-4). A mais abundante em tecido renal é a isforma 3 (NHE3), presente em membrana luminal de túbulos proximais e de segmento espesso ascendente. Por este mecanismo de secreção de íons se dá a reabsorção de bicarbonato. A figura 3.9 ilustra o processo. A acidificação luminal desloca o equilíbrio das reações de hidratação do CO2 e de dissociação do ácido carbônico na direção da formação de CO2 e consumo do bicarbonato na luz do túbulo. A concentração deste na luz é reduzida. O bicarbonato gerado na célula é transportado na membrana basolateral por um carregador que realiza a transferência simultânea de 3Na+ e bicarbonato. Esse processo na membrana basolateral permite o transporte de sódio, da célula para o espaço peritubular, contra uma diferença de concentração e contra a diferença de potencial elétrico. Permite ainda o transporte de bicarbonato com a possibilidade de, pelo gradiente de Na+ na barreira, modular o pH intracelular. O transporte de cloreto em túbulos proximais se faz tanto por via transcelular como paracelular. Em segmento S1, aparentemente o transporte paracelular é o processo dominante. A via transcelular é dominante nas porções finais de túbulo proximal, onde a captação de Cl- contra gradiente através de membrana apical ocorre por meio da troca de Cl- luminal por ânions celulares, como formato, oxalato, HCO3- e OH-. A saída de Cl- através de membrana basolateral aparentemente se faz por um canal para Cl- que é análogo ao canal mutado na doença fibrose cística, “cystic fibrosis transmembrane conductance regulator” – CFTR. Além disso, na membrana basolateral parece estar presente também o co-transportador K+-Cl-. A reabsorção passiva de Cl- por via paracelular é movida por diferentes gradientes eletroquímicos para o Cl-, em segmentos inicial e final do túbulo proximal. No segmento S1, inicialmente não há diferença na concentração de Cl- entre a luz e o sangue. Entretanto, a voltagem lúmen-negativa – gerada pelos co-transportes eletrogênicos - especialmente Na+/glicose e Na+/aminoácidos neutros – estabelece um gradiente elétrico favorável à reabsorção de Cl-. Em S2 e S3, a voltagem lúmen-positiva se opõe à absorção paracelular de Cl-. Entretanto, a reabsorção preferencial de HCO3- nas porções iniciais do túbulo proximal deixa o Cl- na luz, de tal modo que a concentração luminal de Cl- torna-se mais alta que sua concentração no sangue. Este gradiente químico lúmen-sangue, favorável à reabsorção de Cl-, supera o gradiente elétrico, de tal modo que o movimento paracelular de Cl- continua a ocorrer no sentido da reabsorção também nas porções mais distais de túbulos proximais. Hânion HÂnion Ânion Cl- Cl- Cl- + Circulação sistêmica

Hipovolemia Hipotensão Acidose Metabólica NHE3 – knockout mice Schultheis PJ et al Nature Genetics, 1998.

Modulação Pós-Tradução do Trocador NHE3 Fosforilação direta do trocador NHE3 por PKA (S552 e S605); Translocação entre os sub-compartimentos da membrana apical; Interação com outras proteínas formando um complexo funcional.

Atividade NHE3-OKP WB Fosforilação NHE3-OKP

Translocação do NHE3 entre os sub-compartimentos da membrana apical

Leong PK et al, AJP Renal 2006.

MET-LYS-THR-PRO-X-LYS-VAL-LEU-LEU-GLY

Dipeptidil Peptidase IV (CD26) NH2 Pro Ala … Peptídeos envolvidos na homeostase da glicose: Peptídeo glucagon like 1 (GLP-1), Peptídeo glucagon like 2 (GLP-2), Peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (GIP) Peptídeos pancreáticos: Peptídeo YY Neuropeptídeo Y; Substância P; Quimiocinas.

Protease Extracelular mCAP1 Aumenta Probabilidade de Abertura do ENaC It has been demonstrated that proteases are capable of regulating transporter activities in kidney and other tissues. For example, a protein that belongs to the serine protease family has been cloned from A6 cells and named CAP-1. This protein activated the amiloride sensitive epithelial sodium channel ENaC. Dppiv could play a similar role in modulating NHE3 activity. Effect of mCAP on INa in oocytes. Oocytes were injected with Xenopus (left), rat (middle), and human (right) ENaC subunits in the presence of mCAP1 (filled bars) or water (open bars). (Vuagniaux et al., JASN 2000)

Estudos in vivo: Objetivos Avaliar se a DPPIV, em virtude de sua associação física com o trocador NHE3, modula a atividade deste transportador túbulo proximal de rato; Avaliar as possíveis conseqüências fisiológicas desta modulação, ou seja alterações do balanço ácido-base e/ou da homeostase do NaCl.

Modelo Experimental Ratos Wistar machos (190-230g) receberam injeção intraperitoneal de 60 mg/kg/dia de Lys[Z(NO2)]-pyrrolidide (I40) durante 7 dias. Grupo controle: Ratos Wistar machos (190-230g) receberam injeção injeções i.p. contendo um análogo inativo do inibidor I40, Lys[Z(NO2)]-OH.

Medida da atividade catalítica da enzima dipeptidil peptidase IV (DPPIV) e da (gama-GTP) em tecido renal de ratos

Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a atividade do trocador NHE3 em preparação de vesículas de membranas microvilares de túbulos proximais (MMV) Em comparação com o grupo controle, a atividade de NHE3 encontra-se significativamente diminuída (~45%) em ratos que receberam I40 por sete dias.

Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a atividade do co-transportador Na/Pi, NaPi-2, em preparação de vesículas de membranas microvilares de túbulos proximais

Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a expressão de NHE3 em preparação de vesículas de membranas microvilares de túbulos proximais (MMV) Animais tratados com inibidores da DPPIV demonstraram uma redução de (~48)% na expressão relativa de NHE3 em MMV em comparação com animais controle.

Efeito do inibidor da DPPIV (I40) sobre a expressão total de NHE3 em membranas de córtex renal I40 causa ~13% de diminuição de NHE3 total.

Inibidor da DPPIV (I40) provoca translocação do trocador NHE3 de membranas microvilares para o domínio intermicrovilar AP-2 Vilina 1 2 3 4 5 6 7 MMV IMV

Sumário A inibição da atividade catalítica da DPPIV está associada com a inibição da atividade do trocador NHE3 em túbulos proximais renais de ratos. Esta inibição ocorre principalmente em decorrência da redução na abundância de NHE3 em membrana apical; Mecanismo: translocação do NHE3 da superfície microvilar da membrana apical para o domínio intermicrovilar das vesículas revestidas de clatrina.

Peso Corporal, Consumo de Ração e Água e Concentração de Eletrólitos no Plasma CTRL (n = 20) I40 P value Initial Body Weight (g) 218.5 ± 7.8 221.9 ± 7.8 0.7592 Final Body Weight (g) 235.5 ± 7.4 225.2 ± 7.5 0.2308 Weight Gain (%) 8.0 ± 0.9 3.0 ± 0.8* < 0.0001 Food Intake (g/ day) 20.3 ± 1.3 18.8 ± 1.6 0.4986 Water Intake (mL/day) 40.5 ± 4.0 44.91 ± 4.0 0.4487 Plasma Na+ (mM) 147.7 ± 2.3 145.3 ± 2.4 0.4870 Plasma K+ (mM) 4.37 ± 0.09 4.21 ± 0.15 0.3741 Plasma Creatinine (mg/dL) 0.38 ± 0.03 0.44 ± 0.02 0.1243

Efeito da inibição da atividade catalítica da DPPIV sobre o fluxo urinário 52% Aumento do Fluxo Urinário I40 vs. CTRL, n = 20.

RFG: 16% I40 vs. CTRL, n = 20, P = 0.1029. 52% I40 vs. CTRL, n = 8.

Observa-se uma tendência à queda da PAS (5%) e PAD (6%) em ratos tratados com I40, porém esta redução não é significativa.

Efeito do Inibidor da DPPIV sobre o Balanço Ácido-Base CTRL (n = 16) I40 P value Plasma pH 7.35 ± 0.01 7.32 ± 0.01 0.0530 Plasma HCO3- (mM) 22.20 ± 0.51 20.46 ± 0.67 0.0627 Plasma pCO2 (mm Hg) 43.14 ± 1.93 39.50 ± 1.09 0.1457 Urine pH 5.66 ± 0.05 6.36 ± 0.10* < 0.0001 Urine HCO3- (mM) 0.33 ± 0.21 5.33 ± 0.74* 0.0001 FE HCO3- (%) 0.06 ± 0.03 0.85 ± 0.14* 0.0004

Sumário Inibição da atividade catalítica da DPPIV causa diurese e natriurese em ratos. Não há variação significativa do RFG em ratos tratados com I40 vs. controle. Ratos tratados com I40 podem apresentar acidose metabólica moderada. Ocorre uma tendência à redução da MAP em ratos normotensos tratados com I40, mas esta redução não é significativa. O menor ganho de peso em animais tratados com I40 em relação ao grupo controle pode ser em parte devido a maior eliminação de sódio e água ocasionada pela inibição da atividade da DPPIV.

Bases Moleculares: Modulação de NHE3 por DPPIV Qual o mecanismo pelo qual inibidores da DPPIV inibem a atividade de NHE3? Hipótese: DPPIV pode degradar um peptídeo inibidor de NHE3. Qual a identidade deste peptídeo? Será que este inibidor age diretamente ou por meio de segundos mensageiros?

Bases Moleculares: Modulação de NHE3 por DPPIV Qual o mecanismo pelo qual inibidores da DPPIV inibem a atividade de NHE3? Hipótese: DPPIV pode degradar um peptídeo inibidor de NHE3. Qual a identidade deste peptídeo? Será que este inibidor age diretamente ou por meio de segundos mensageiros?

Bases Moleculares: Modulação de NHE3 por DPPIV Qual o mecanismo pelo qual inibidores da DPPIV inibem a atividade de NHE3? Hipótese: DPPIV pode degradar um peptídeo inibidor de NHE3. Qual a identidade deste peptídeo? Será que este inibidor age diretamente ou por meio de segundos mensageiros?

Identificação Maldi-TOF: Miosina IIa Correlação entre os aspectos estruturais e funcionais do complexo NHE3-DPPIV: Identificação das proteínas acessórias que fazem parte deste complexo protéico em túbulo proximal renal. 220 116 97 45 GST fpDPPIV fpNHE3 fpNHE3 (295-491) (702-756) (757-829) Identificação Maldi-TOF: Miosina IIa

Modelo Proposto: Modulação de NHE3 por DPPIV GLP1 GLP1 NHE3 MIIa DPPIV GLP1R

Gerhard Malnic Lívia E. Fukuda Luciana V. Rossoni Lisete C. Michelini Luciene R. C. Lacroix Nancy A. Rebouças Daniel Biemesderfer Florence J. Wu Peter S. Aronson Robert B. Thomson