BIOLOGIA MOLECULAR 3/26/2017 Tecnologia do DNA recombinante

Conteúdo DNA recombinante Enzimas de restrição Vetores de clonagem 3/26/2017 Conteúdo DNA recombinante Enzimas de restrição Vetores de clonagem - Plasmídios - Bacteriófagos - Cosmídeos 4. Etapas de clonagem molecular 5. Aplicações

Tecnologia DNA recombinante Insulina recombinante 3/26/2017 HISTÓRICO Tecnologia DNA recombinante Insulina recombinante (1978) Ian Wilmut clonagem de mamífero (1997) Watson & Crick Estrutura do química do DNA (1953) Nature, 25 - Abr - 1953

Conhecer genoma H. sapiens 3/26/2017 HISTÓRICO Prática clínica Testes genéticos (1995...) PGH Conhecer genoma H. sapiens (1995-2003) Transgenia

O que é um DNA recombinante? 3/26/2017 O que é um DNA recombinante? - É uma molécula de DNA formada pela ligação de duas moléculas de origens diferentes (Ex. DNA de planta ligado a um plasmídio)

3/26/2017 “A engenharia genética atua no nível molecular, onde as diferenças entre espécies desaparecem”

3/26/2017

3/26/2017 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Descritas em 1970, 3/26/2017 Descritas em 1970, W. Alber H. Smith D. Nathans Uma enzima de restrição ou endonuclease de restrição é um tipo de nuclease que cliva fita dupla de DNA sempre que identificar uma seqüência particular de nucleotídios que seja o sítio de restrição da enzima;

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 3/26/2017 Função Natural: proteger o DNA bacteriano do DNA exógeno

A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita: ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 3/26/2017 A enzima BamHI reconhece a seqüência dupla fita: BamHI - reconhecem seqüências específicas de nucleotídeos no DNA, atuando como verdadeiras tesouras moleculares

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Nomenclatura BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H 3/26/2017 Nomenclatura BamHI - Bacillus amyloliquefaciens H 5’ G/GATCC 3’ EcoRI - Escherichia coli R 5’ G/AATTC 3’ HaeIII - Haemophilus aegyptius 5’ GG/CC 3’ PstI - Providencia stuartii 5’ CTGCA/G 3’

370 C, 1 hora, com tampão adequado ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 3/26/2017 EcoRI 370 C, 1 hora, com tampão adequado

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Tipos de cortes: 3/26/2017 Tipos de cortes: - Produção de terminais coesivos (adesivos, protuberantes) - Produção de terminais abruptos (ou cegos)

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO ~~~~~~ 3/26/2017 NarI ~~~~~~ 181 ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC TGGTATACGC CACACTTTAT GGCGTGTCTA CGCATTCCTC TTTTATGGCG TAGTCCGCGG 241 ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT TAAGCGGTAA GTCCGACGCG TTGACAACCC TTCCCGCTAG CCACGCCCGG AGAAGCGATA 301 TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT ATGCGGTCGA CCGCTTTCCC CCTACACGAC GTTCCGCTAA TTCAACCCAT TGCGGTCCCA HindIII PstI ~~~~~~~ ~~~~~~ 361 TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCC GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC XbaI BamHI KpnI EcoRI ~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~ ~~~~~~~ 421 ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT TGAGATCTCC TAGGGGCCCA TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA

3/26/2017 TIPOS DE VETORES

Vetores Hospedeiros Utilização TIPOS DE VETORES 3/26/2017 Vetores Hospedeiros Utilização clonagem Plasmídeos Bactérias / leveduras Cosmídeos Bacteriófagos

VETORES PLASMIDIAIS 3/26/2017 Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossomais, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras pUC18 pBR322 pUP310 Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9 kb

Vetor de Expressão em Procarioto VETORES PLASMIDIAIS 3/26/2017 Vetor de Expressão em Procarioto

Vetor de Expressão em Eucariotos VETORES PLASMIDIAIS 3/26/2017 Vetor de Expressão em Eucariotos

Vacina Vetorizada (rBCG)

Vetor de Expressão em Eucariotos VETORES PLASMIDIAIS 3/26/2017 Vetor de Expressão em Eucariotos

Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb BACTERIÓFAGO 3/26/2017 Vírus que infectam bactérias; Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb

BACTERIÓFAGO 3/26/2017 Ciclo Lisogênico Ciclo Lítico

São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos; COSMÍDEOS 3/26/2017 São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos; - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb;

Características essenciais VETORES DE CLONAGEM 3/26/2017 Características essenciais Replicação autônoma Marcador de seleção (antibiótico) Sítio único de clonagem

Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG VETORES DE EXPRESSÃO 3/26/2017 Necessitam de um promotor forte, de um RBS e de ATG Promotores induzíveis Sinais de secreção Fusão com proteínas carreadoras

3/26/2017 CLONAGEM MOLECULAR

CLONAGEM MOLECULAR 3/26/2017 É o isolamento e a propagação em um organismo de moléculas idênticas de DNA

CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE 3/26/2017 CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE 1. Obtenção do DNA a ser clonado 2. Preparação do vetor 3. Ligação do vetor com o “inserto” 4. Transformação da bactéria 5. Seleção dos clones recombinantes

1.Obtenção do DNA a ser clonado 3/26/2017 1.Obtenção do DNA a ser clonado Extração de DNA; PCR Digestão Purificação

1.Obtenção do DNA a ser clonado 3/26/2017 1.Obtenção do DNA a ser clonado PCR 94 0C por 5 min 94 0C por 1 min 55 0C por 1 min 72 0C por 1 min 72 0C por 5 min 4 0C 35 ciclos

Eletroforese em gel de agarose 3/26/2017 Eletroforese em gel de agarose

Visualização do DNA em luz ultravioleta 3/26/2017 Visualização do DNA em luz ultravioleta

Digestão com Enzimas de restrição 3/26/2017 3.Preparação do vetor Digestão Purificação Plasmídeo linear Plasmídeo Circular Digestão com Enzimas de restrição

4. Ligação DNA plasmidial - vetor Fragmento de DNA - inserto LIGASE 3/26/2017 4. Ligação Extremidades coesivas Fragmento de DNA - inserto DNA plasmidial - vetor LIGASE

5.Transformação da bactéria 3/26/2017 5.Transformação da bactéria CHOQUE TÉRMICO

5.Transformação da bactéria 3/26/2017 5.Transformação da bactéria ELETROPORAÇÃO

5.Transformação da bactéria 3/26/2017 5.Transformação da bactéria ELETROPORAÇÃO

6.Seleção dos clones recombinantes 3/26/2017 6.Seleção dos clones recombinantes

Construção do DNA Recombinante 3/26/2017 Construção do DNA Recombinante Molécula de DNA de um plasmídeo circular Molécula de DNA de um plasmídeo linear com extremidades coesivas anelamento Clivagem com enzima de restrição Ligação covalente pela DNA ligase Inserção em uma célula hospedeira Molécula de DNA plasmidial contendo o inserto

Extração de DNA de L. interrogans 3/26/2017 Extração de DNA de L. interrogans Leptospira interrogans meio EMJH Extração de DNA PCR 94ºC – 5 min 94ºC – 1 min 50ºC – 1 min 72ºC – 1 min 72ºC – 7 min 30 ciclos

Construção dos Vetores Clonagem em Vetores de expressão PCR   Transformação E. coli Seleção dos Clones recombinantes lipL32 768 pb Extração Digestão Triagem 768 pb

Expressão de Proteínas Recombinantes Purificação da Proteína Cultura de Células Transformação da E. coli

Purificação de proteínas recombinantes 3/26/2017 Purificação de proteínas recombinantes Ligação Transformação por Eletroporação Extração de DNA plasmidial E. Coli DH5 pLysS codon pluss Transformação por Choque Térmico SI E. coli (BL21) DE3 Cepas de E. coli para expressão de proteínas

SDS-PAGE (Eletroforese de proteínas) 3/26/2017 SDS-PAGE

Expressão de Proteínas Recombinantes 3/26/2017 Expressão de Proteínas Recombinantes Expressão em diferentes cepas de E.coli

Purificação de Proteínas Recombinantes 3/26/2017 Purificação de Proteínas Recombinantes Akta Prime Gel de poliacrilamida 15%. 1 2 3 4 30kDa BENCHMARKTM Protein Ladder em kDa 2, 3 e 4. LipL32 purificada (eluições).

3/26/2017 APLICAÇÕES

VACINAS RECOMBINANTES Vetor Plasmidial L. interrogans pAE pTARGET pUS973 pUS974 pUS977 E.coli (BL21) E.coli TOP10 Vacina de DNA BCGr lipL32 1. PCR 2. Clonagens 3. Multiplicação 4. Vacinação Proteína Recombinante

3/26/2017 ANIMAIS TRANSGÊNICOS

3/26/2017 PLANTAS TRANSGÊNICAS