Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica Prof.Doutor José Cabeda

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

Espectrofotometria max L=1 cm A(suporte) A(solvente) Lei de Bert-Lambert C=eA

Espectrofotometria max L=1 cm A(suporte) A(solvente) Lei de Bert-Lambert C=eA max L=1 cm A(suporte) A(solvente)

Espectofotometria

Espectrofotometria max L=1 cm A(suporte) A(solvente) A(contaminantes) Lei de Bert-Lambert C=eA max L=1 cm A(suporte) A(solvente) A(contaminantes)

Quantificação de DNA max=260 nm max(proteínas) =280 nm ref =320 nm Concentração = f(OD260). Se L=1cm: dsDNA 1OD=50µg/ml ssDNA 1OD=40µg/ml ssRNA 1OD=40µg/ml Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência) (se puro deve situar-se entre 1.75 e 2)

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

Fazer um gel de agarose

Electroforese

ELECTROFORESE V=IR P=I2R A resistência é inversamente proporcional á secção e á força iónica da solução

TIPOS DE GEIS Agarose (TAE e TBE) Acrilamida Horizontais Verticais Seakam Nusieve Nusieve 3:1 outras (LMP, HGT, etc) formamida como desnaturante Acrilamida Acrilamida/bisacrilamida /TEMED /peróxido de amónio SDS como desnaturante Horizontais Verticais

Limitações da Electroforese Eficaz de 100bp até no máximo 50kb Deixa de fora muitos fragmentos Deixa de fora os cromossomas Não permite separar simultâneamente os fragmentos pequenos e grandes Ineficaz para caracterizar genotipos complexos de organismos

Electroforese Convencional Matriz semisólida Campo eléctrico uniforme Estático Moleculas migram Segundo uma única dimensão Uniformemente ao longo da electroforese

Solução: PFGE Campo eléctrico variável Direcção variavel Duração variável Intensidade variável As moléculas respondem ao campo elétrico: Reorientando-se (a maior parte do tempo) Reorientação dependente do ângulo dos campos elétricos anternantes Migrando no gel (no tempo que sobra)

Electroforese em Campo Pulsado (PFGE) Field-inversion G.E. Transverse-Alternating Field G.E. Rotating Gel Electrophoresis Contour-Clamped Homogeneous Electric Field Orthogonal-FieldAlternation G.E. Programable Autonomously-controled Electrodes Pulsed Homogeneous Orthogonal Field Gel Electrophoresis

Field inversion gel electrophoresis (FIGE) Ângulo de 180º Pulsos Forward/reverse Tempo F/R=3:1 Se pulsos aumentam com a corrida, melhora a resolução (swich time ramping) Resolução aceitável até 800 kb

Traverse-alternating field gel electrophoresis (TAFE) Gel vertical Campos eléctricos fora do plano do gel DNA zigzagueia no gel Ângulo dos campos difere ao longo do gel Aumenta a resolução pois DNA maiores menor ângulo de reorientação DNA menores maior ângulo de reorientação Separações até 1,600 kb

Rotating Gel Electrophoresis (RGE) Gel roda com campo desligado Campo eléctrico uniforme Fácil de fazer protocolos com Ramping voltage Ramping time pulse Ângulo variável Tempo para a mudança do ângulo é o mais longo Separações de 50 kb a 6000 kb

Contour Clamped Homogeneous Electric Fields (CHEF) Solução mais sofisticada Campo elétrico uniforme resistores aplicados a todos os 24 eléctrodos Todas as “lanes” são perfeitamente paralelas Ângulo de reorientação de 120º Separações até 7,000 kb

Aspectos Criticos em PFGE Voltagem 6-10V/cm (DNA< 1 Mb) <2 V cm (3-6 Mb) 1.5 V/cm (>12 Mb) Menor V => aumento tempo Temperatura Arrefecimento e recirculação do tampão é mandatório Ar condicionado eficiente e 24h/dia – 7dias/semana 14ºC – 22ºC Escolha da enzima de restrição Deve originar: Grandes fragmentos Poucos fragmentos Pulse Time e rapidez de mudança Suficientemente longo para haver corrida Suficientemente curto para haver principalmente reorganização Forma do campo eléctrico Número e configuração dos eléctrodos Ângulo dos campos Sempre >100º Óptimo entre 120º e 150º Nunca ≤90º Ângulos variáveis tornam as bandas mais finas

Utilização do PFGE Genotipagem bacteriana Discriminação de surtos de infecção nosocomial Estudos epidemiológicos da mobilidade de estirpes bacterianas patogénicas Mapas genéticos de mais de 180 bactérias Mapa do genoma humano Isolamento e caraterização de cromossomas Construção de bibliotecas Construção de YAC Produção de Ratinhos transgénicos

Exemplo de PFGE

Electroforese Capilar Electroforese em capilares de pequeno diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro interno) Utiliza campos eléctricos muito elevados (20-30 kV), já que os capilares dissipam o calor com muita eficiência Separações muito boas, num período de tempo inferior.

Electroforese Capilar (II) Elevada voltagem Grande velocidade Produção de calor Janela de detecção Capilar fino Eficiente gestão do calor Matriz de separação Tampão condutor

Electroforese Capilar (III) Fluxo Electroendosmótico (FEO) Superfície do capilar C/ grupos negativos Junto à superficie grupos positivos: migram para o polo negativo arrastam consigo o tampão/solvente Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO Moléculas negativas são mais lentas que o FEO todas as moléculas migram para o pólo negativo velocidade depende da carga e do peso molecular

Electroforese Capilar (IV) Detecção por fluorescência Moléculas marcadas Fluorocromos c/ afinidade Sinal quantitativo Grande sensibilidade Sinal em função do tempo Imagem de gel simulada Grande resolução

Electroforese Capilar (V) Videos: 1-Load Matrix 2-Load Samples/markers 3-Run DNA Demo

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS Brometo de etidio e análogos Radioactividade 32P e 33P 35S 125I 14C 3H Tempos de exposição Cassetes com e sem ecran repetidor Necessidade de secagem dos geis Nitrato de prata

Marcação de sondas Radio-isótopos 32P 33P 35S 3H 14C 125I

Marcação de sondas Digoxigenina Biotina detecção directa da cadeia dupla

Enzimas para a marcação de sondas Polimerases Actividade exonucleolitica Temp. optima estabilidade térmica TdT

Tipos de sondas Oligonucleótidos inserts de plasmideos prod. de PCR

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

Fotografia

FOTOGRAFIA Abertura do diafragma Tempo de exposição Focagem e profundidade de foco Filtros necessários Tipos de fotos Polaroid Sistemas alternativos

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

Aquisição computorizada de imagens de geis

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

Integração de histogramas

Quantificação e caracterização de ácidos nucleicos Espectrofotometria Electroforese Revelação dos ácidos nucleicos Fotografia Sistemas computadorizados de aquisição de imagem Quantificação de bandas em geis Reacções de restrição Sistemas R/M Montar uma reacção de restrição

Reacção de restrição

SISTEMAS R-M Protecção contra DNA estranho TIPO I: pouco frequentes (1%) TIPO II: (93% das enzimas) reconhecem sequencias simétricas cortando entre as sequencias As endonucleases requerem Mg2+ e as metiltransferases requerem s-adenosylmetionina endonucleases compostas por um homodimero metiltransferases compostas por monomero

SISTEMAS R-M TIPO IIs: como as Iis, mas com sequencias de reconhecimento assimétricas e interrompidas local de corte a até 20 nucleótidos da sequência reconhecida Metilação efectuada po 2 metilases (uma para cada cadeia, podendo ser metiladas bases diferentes em cada cadeia) TIPO III: pouco frequentes (<1%) TIPO IV: as restantes

MONTAR UMA REACÇÃO DE RESTRIÇÃO Instabilidade térmica Concentração de glicerol Tampão de reacção Actividade enzimática: 1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora conformação e pureza do DNA utilizar 2-3 x mais enzima volume total > 50µl Homogeneizar por pipetagem Verificar a temperatur de reacção