Técnicas de Biologia Molecular em microbiologia Clínica Técnicas de estudo de mutações desconhecidas Prof.Doutor José Cabeda

Técnicas de estudo de mutações desconhecidas Métodos Baseados No Tm Melting Profiles and GC clamps DGGE Perpendicular Paralelo CDGE TTGE Métodos Baseados na conformação SSCP HA CSGE

“Melting Profiles” Vários domínios de fusão As moléculas de DNA fundem por etapas Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Gradiente de desnaturação Químico Temperatura O gradiente pode ser: Perpendicular ao campo eléctrico Paralelo ao campo eléctrico

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) heteroduplexes homoduplexes

Constant Denaturing Gel Electrophoresis (CDGE)

Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) Não existe um gradiente no gel, em cada momento da corrida Existe uma temperatura crescente ao longo da corrida Em cada momento, a migração em cada molécula depende de esta já ter atingido ou não algum domínio de fusão

Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TTGE) Vantagens Mais fácil de fazer os geis Mais reprodutível de gel para gel Desvantagens Mais difícil de acertar a gama de Tm

HR-1 0.01ºC/s a 1ºC/s Tambiente a 100ºC High Resolution Melter 24bit Fluorescence 24bit Temperature 5-20µL Volume 40-45 amostras/h (0.3ºC/s) LCGreen I Excitação a 440-470nm Emissão a 470-520 nm High Resolution Melter

HR-1

Métodos baseados na conformação Conformação do dsDNA não depende da sequência A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de “mismatch” Conformação do ssDNA depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência)

Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido Renaturação rápida Corrida em condições semi-desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Temperatura de corrida Concentração de desnaturante Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) WT1 mutantes WT2

Heteroduplex Analysis (HA) Heterodupletos causam Distorção na conformação Migração no gel mais lenta Heterodupletos podem existir por: Co-amplificação por PCR de heterozigotos Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M

Heteroduplex Analysis (HA) Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA

Conformation Sensitive Gel Electrophoresis Principio: Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a capacidade de mutações pontuais produzirem alterações conformacionais. Método: Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina e 100% PEG e 15% formamida (desnaturante) Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”, aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros Utilizar fragmentos com 300-800 bp

DHPLC Coluna Hidrofóbica Interacção entre coluna e DNA efectuado pelo Acetato de Trietilamónio (TEEA) Libertação da retenção efectuada por um gradiente crescente de Acetonitrilo (ACN) ssDNA menos retido que dsDNA

DHPLC BRCA1 Perfil de utilização dos Tampões

Transgenomics DHPLC Wave Systems 3500 4000Plus Microbial 3500HT

Hibridização desnaturar

Hibridização Adicionar sonda

Hibridização

Hibridização

Dot-Blot

Variações Hibridização em microplaca hibridização reversa

DEIA (hibridização reversa em microplaca) (detecção com anti-dsDNA)

Inno-Lippa Hibridização em filtro Várias sondas por filtro dispostas em tiras (tipo código de barras) Hibridização reversa Marcação no produto do PCR

Resultados do INNO-LIPA

MEIA

MEIA                                                                                                          

Southern Blot

Northern Blot Semelhante ao Southern Utiliza RNA e não DNA Não utiliza reacções de restrição

Hibridização em microchip Miniaturização de um dot-blot Densidade variável Hibridização automática Leitura automática

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