Introdução: Aproximadamente um terço da população mundial está infectada por M. tuberculosis. 9 milhões de novos casos por ano. 1,8 milhões de mortes por ano.
Introdução: Por que a procura de antígenos novos são importantes? Produção de reagentes para diagnóstico e novas vacinas. PPD
Introdução: O genoma do M. tuberculosis possui 16 regiões do genoma deletadas em outras Mycobactérias (utilizadas para BCG, por exemplo)
Introdução: Rv3874 Rv3875 Rv3619c O que se tinha? O que foi feito: Overlaping (peptídeos sintéticos) In vitro (ativação de linfócitos T) Rv3874 Rv3875 Rv3619c Proteína inteira In vivo O que foi feito:
Clonagem: Amplificação: PCR DNA M. tuberculosis Iniciadores dNTPs Enzima + Tampão Purificação Ligação
Ligação: vetor de clonagem univeral Transformação: Choque térmico
Outras técnicas de transformação: Genegun Eletroporação Vírus
Seleção das culturas: Ampicilina Outras técnicas de seleção: Bioluminescência Azul/branco
Restrição enzimática: BamHI e Hind III Ligação no vetor de expressão:
Inseriram a sequencia para cauda de histidina no pGEX Vantagem: duplo sistema de purificação
Expressão: Transformação: Choque térmico Seleção das colônias Sequenciamento Expressão: IPTG
Purificação: Resina, para retirar a GST + Coluna de Ni, para retirar a cauda de Histidina
Purificação:
Western Blotting: Anticorpo: anti- GST Anticorpo: anti- His
Imunização: Rv3874 Rv3875 Rv3619c + Adjuvante de Freud 2 apresentações com 2 semanas de intervalo Após 2 semanas retira-se o soro
Elisa:
Resposta Imune celular: Linfócito B
Epítopos lineares: ABCPred Predition server Proteínas também geraram epítopos lineares, assim como os peptídeos, na imunização
Conclusões: O vetor construído e a dupla purificação são eficientes As proteínas são imunogênicas nos coelhos Questionamento: Qual a vantagem da produção da proteína recombinante para a resposta imune em coelhos?